– MeioticDSB

Introduction Un programme unique de formation de cassures double-brins de l'ADN (CDBs) est induit pour initier la recombinaison entre chromosomes homologues en début de prophase de méiose. On estime à environ 250 le nombre de CDBs ainsi induites dans des ovocytes ou spermatocytes de souris. Ces CDBs sont réparées par interaction avec le chromosome homologue et contribuent ainsi à l'appariement entre homologues et conduisent à la formation de crossing over, essentiels pour la ségrégation réductionnelle. Notre projet a pour objectif de comprendre comment et où ces événements d'initiation se produisent chez la souris. Chez la souris, deux protéines ont été montrées être impliquées dans cette étape : Spo11 qui porte l'activité catalytique de formation des CDBs compte tenu de son homologie avec une famille de topisomérases de type II, et Mei1 dont le rôle est inconnu. L'étape de formation des CDBs implique très probablement d'autres protéines compte tenu de la régulation et des contrôles qui doivent être mis en place aussi bien au niveau spatial que temporel. Chez la levure S. cerevisiae, il a été montré qu'au moins dix autres gènes sont requis pour la formation des CDBs et sont en interaction directe ou indirecte avec Spo11, suggérant la formation d'un (ou plusieurs) complexe protéique d'initiation. Objectifs et méthodologie Notre premier objectif est d'identifier les protéines impliquées dans la formation des CDBs, à partir d'une analyse approfondie de la protéine Spo11, en testant l'interaction entre Spo11 et Mei1, et en recherchant des protéines interagissant avec Spo11. - Recherche de protéines interagissant avec Spo11 par double-hybride dans la levure - Où et quand Spo11 est elle présente ? Analyse de souris exprimant la protéine EGFP-Spo11 - Ciblage de l'activité de Spo11 dans le génome : analyse de souris exprimant la protéine Cre-Spo11 - Rôle de la tyrosine prédite essentielle pour l'activité catalytique : analyse de souris portant la mutation Spo11Y100F Les nombreuses analyses de détection des CDBs chez la levure ainsi que les cartographies à haute résolution des crossing over chez les mammifères montrent que les sites d'initiation ne sont pas distribués au hasard. La recherche d'éléments de contrôle de la position et de l'activité des sites d'initiation constitue la deuxième partie de notre projet. Nous développerons plusieurs stratégies en tirant partie de nos travaux récents sur l'analyse du site d'initiation Psmb9 (Guillon and de Massy, Nat Genet 2002; Guillon et al., Mol Cell 2005). - Peut on détecter et cartographier les CDBs au site Psmb9 ? Développement d'une nouvelle stratégie. - Peut-on démontrer la nature réciproque ou non d'un événement de recombinaison et ainsi valider un des aspects essentiels du mécanisme de réparation des CDBs ? Développement d'une nouvelle méthode sur ovocytes isolés - Quels sont les éléments de contrôle de l'activité du site Psmb9 ? Nous comparerons l'activité de ce site dans différents hybrides. - L'activité de Psmb9 ou la formation des produits de recombinaison sont-elles affectées par la méthylation de l'ADN ? - Quel est le rôle de Mlh3 en méiose ? En continuité directe avec nos travaux sur le rôle de Mlh1, nous étudierons Mlh3, une protéine impliquée dans la réparation des mésappariements et dans la formation des chiasma. Nous analyserons la recombinaison méiotique dans les souris Mlh3KO.