– Ini-Targt HR

La recombinaison homologue au cours de la méiose a deux rôles essentiels : elle est requise pour la ségrégation réductionnelle des chromosomes, qui conditionne la production de gamètes haploïdes viables, et permet le réassortiment des allèles portés par les chromosomes parentaux, générant la diversité génétique transmise par les gamètes. Inversement, l'absence de recombinaison entraîne le maintien des combinaisons alléliques ancestrales, définissant les haplotypes. Importants pour la reproduction et la santé, les dysfonctionnements de la recombinaison méiotique conduisent à la formation de gamètes anormaux, responsables notamment de l'infertilité et des trisomies. La compréhension, voire la prévention, de telles anomalies constitue un espoir important, justifiant l'approfondissement des connaissances fondamentales sur la recombinaison méiotique. Les mécanismes et le contrôle de la recombinaison méiotique sont les mieux caractérisés chez la levure S. cerevisiae. La recombinaison est initiée par la formation programmée de coupures double-brin (CDBs) de l'ADN, générées par la protéine Spo11, qui sont ensuite réparées par recombinaison homologue. D'autres protéines, probablement associées de façon dynamique en complexes, sont requises, mais leur fonction est largement inconnue. Les connaissances sur les points chauds de recombinaison sont plus avancées. Ils agissent localement et leur activité est corrélée à une structure ouverte de la chromatine. Récemment, l'utilisation de puces à ADN a permis de cartographier l'ensemble des sites de CDB du génome de la levure : ils sont distribués de manière hétérogène, définissant des régions chromosomiques chaudes ou froides. Pour comprendre le mécanisme d'initiation de la recombinaison méiotique et le maîtriser en vue d'applications, nos travaux chez la levure visent à : 1) Caractériser les complexes protéiques qui s'associent avec les régions d'initiation, et déterminer leur ordre temporal et leur relations fonctionnelles ; 2) Amorcer la caractérisation biochimique des protéines responsables de la formation des cassures double-brin initiatrices, Spo11-dépendantes 3) Déterminer les facteurs qui contrôlent, localement et globalement, la distribution stochastique des sites de coupures (150 par cellule) le long des chromosomes. Puis, prenant avantage de l'accumulation rapide des connaissances chez la levure-modèle, nous souhaitons désormais étendre de manière parallèle, nos travaux chez la souris. En particulier, nous souhaitons stimuler et cibler l'initiation de la recombinaison méiotique en exprimant une protéine de fusion Gal4BD-mSpo11, ainsi que nous l'avions réalisé chez la levure. En effet, comme chez la plupart des organismes, le taux moyen de recombinaison méiotique (0,5 cM/Mb) chez la souris est environ 1000 fois plus faible que chez la levure. Dans la pratique, ceci limite fortement la possibilité d'obtenir des recombinants entre les gènes liés physiquement, et quasiment exclut la possibilité d'obtenir des recombinaisons intragéniques. Pour stimuler la recombinaison dans la lignée germinale murine, nous proposons de construire et d'analyser des souris transgéniques exprimant : 1) La protéine de fusion Gal4BD-m- alpha-Spo11 sous un promoteur court SyCP1, mâle et méiose spécifique. Cette souris transgénique est construite ; 2) La protéine de fusion Gal4BD-m-beta-Spo11 sous un promoteur SyCP1 long, permettant l'expression méiose-spécifique dans les deux sexes ; 3) Une cassette rapporteur pCAG-LuaZ permettant de mesurer in vivo la recombinaison ciblée intra- et inter-allélique ectopiques et les transferts de séquences dans la lignée germinale, reconstituant un gène LacZ fonctionnel. 4) Une cassette « optimale » Gal4BD-m-beta-Spo11 pCAG-LuaZ contenant les deux transgènes. Le développement de méthodes de stimulation et de ciblage de la recombinaison méiotique devrait être d'un grand intérêt scientifique dans le domaine et constituer un nouvel outil pour faciliter l'ingéniérie in vivo .