La maturation et la recyclage de l'ARN chez B. subtilis: de l'identification des acte à la résolution de leur structure – SubtilRNA

Escherichia coli et Bacillus subtilis, les deux bactéries le mieux étudiées, sont des organismes très différents qui ont divergé il y a plus d'un milliard d'années. Rien d'étonnant donc à ce qu'ils aient développé des voies très différentes pour réaliser certains processus cellulaires. La maturation et la dégradation de l'ARN en sont d'excellents exemples. Ainsi, sur les vingt-six ribonucléases (RNases) identifiées chez ces deux organismes, huit seulement leur sont communes. Il est remarquable de noter que la plupart de ces RNases conservées ne sont pas essentielles à la viabilité cellulaire. Le mécanisme de la dégradation, tant au niveau de la chimie qu'à celui de son déclenchement, diffère également. Chez E. coli, tous les outils sont maintenant disponibles pour caractériser en détail les voies de maturation et de dégradation de l'ARN. En revanche, chez B. subtilis, les principales RNases sont encore inconnues. Les objectifs principaux de ce projet sont: l'identification des RNasesles plus importantes de B. subtilis, la caractérisation de leur rôle dans la dégradation de l'ARN et la détermination de leur structure cristallographique. Ces enzymes seront identifiées soit par comparaison de séquences avec des RNases hétérologues récemment découvertes, soit par purification directe par chromatographie classique suivie de tests enzymatiques sur des ARN stables (ARNr et ARNt). L'expérience a montré que certaines RNases intervenaient à la fois dans le métabolisme des ARNm et dans celui des ARN stables. L'identification de nouvelles RNases permettra la construction de mutants afin d'étudier leur rôle potentiel dans les voies de dégradation de l'ARNm in vivo. Les ARNm cibles des RNases-clés seront identifiés in vivo par analyse de transcriptome et confirmation par Northern blot, et in vitro par des tests de clivage et de dégradation de l'ARN. Notre laboratoire a identifié quatre nouvelles RNases chez B. subtilis: YkqC, la RNase M5, la RNase Z et EndoA, impliquées dans la maturation de l'ARNr pour les deux premières, la maturation de l'ARNt pour la troisième et la dégradation de l'ARNm pour la dernière. Les partenaires principaux de ce projet ont déjà résolu la structure cristallographique de la RNase Z à 2.1Å. Les structures de deux homologues d'EndoA chez E. coli sont connues aussi. Nous allons tenter de résoudre les structures de YkqC et de la RNase M5 en présence et en absence de leur substrat. Nous poursuivrons également nos études sur la RNase Z afin de comprendre le mécanisme moléculaire par lequel cette enzyme discrimine les ARNt contenant un motif CCA. Les nouvelles RNases identifiées au cours de ces études seront également soumises à des cribles cristallographiques. A travers nos résultats, nous espérons amener la compréhension des mécanismes de la maturation et la dégradation de l'ARN chez les bactéries à Gram-positif au niveau atteint chez E. coli.