Rôle de l'interaction mastocyte -cellule musculaire lisse bronchique humaine dans l'asthme allergique – ANR-05-SEST-0042

Les pneumopathies d’hypersensibilité (PHS) sont des maladies immuno-allergiques consécutives à l’inhalation répétée de substances antigéniques, notamment d’origine fongique. Du fait de la relation étroite entre l’exposition et la maladie, la réalisation de tests sérologiques utilisant des antigènes issus de l’environnement des malades a un intérêt majeur pour le diagnostic. Par ailleurs, une meilleure compréhension des mécanismes immuno-allergiques impliqués pourrait permettre le développement de nouvelles thérapies. Les objectifs de notre projet sont d’une part d’améliorer le diagnostic sérologique des PHS, d’autre part de contribuer à la meilleure connaissance du rôle spécifique des différentes cellules et des différents médiateurs intervenant dans la pathogenèse de ces maladies. Pour cela, nous nous proposons de détecter et d’isoler les moisissures présentes dans l’environnement des patients, puis d’identifier les antigènes d’intérêt pour le diagnostic, pour pouvoir ensuite développer des antigènes recombinants. Ces antigènes recombinants seront ensuite utiliser pour la mise au point de nouveaux tests diagnostiques, ainsi que pour l’étude des mécanismes physiopathologiques sur des modèles cellulaires d’épithélium respiratoire. Le projet présenté ici comprend le recrutement rétrospectif et prospectif de patients atteints de PHS (recueil des données cliniques et de sérums). Des enquêtes de terrain avec le recueil des souches de moisissures dans l’environnement des sujets malades seront réalisées. L’identification d’antigènes d’intérêt pour le diagnostic sera effectuée par deux approches : 1 / séparation des antigènes extraits de ces moisissures par électrophorèse, et repérage des antigènes d’intérêt par Western blotting en utilisant les sérums de sujets malades, 2/ criblage d’une banque d’antigènes d’Aspergillus fumigatus exprimés par des bactériophages en utilisant les sérums de sujets malades (technique « phage dysplay library»). Les antigènes recombinants seront produits, en utilisant la séquence des gènes codant pour les antigènes identifiés, dans les systèmes d’expression E. coli ou Pichia pastoris. Plusieurs types de tests sérologiques utilisant les antigènes recombinants seront ensuite développés et évalués : des méthodes classiques de précipitation et des méthodes immunoenzymatiques (ELISA), ainsi que des méthodes immunofluorimétriques, plus sensibles. L’étude des mécanismes immuno-allergiques sera réalisée sur plusieurs modèles d’épithélium respiratoire. En premier lieu, les principales cytokines spécifiques des réponses TH1 et TH2 seront analysées sur les lignées cellulaires A549 et BEAS-2B par « reverse » PCR quantitative en temps réel après stimulation par les différents antigènes retenus. Les résultats seront validés sur un modèle de cultures primaires de cellules trachéales de porc. L’étude des cytokines sera complétée par des études morphologiques et électrophysiologiques. Enfin, des confirmations sur un modèle humain de cellules épithéliales nasales humaines en interface air-liquide seront réalisées. L’ensemble de ces travaux devrait apporter des éléments nouveaux pour la prise en charge des PHS, tant au niveau de la prévention, par l’amélioration des méthodes de diagnostic et des mesures d’éviction, que du traitement, par la meilleure compréhension de la pathogenèse, indispensable au développement de nouveaux médicaments.