Identification de gènes d'ataxie récessive et de leurs mécanismes moléculaires en relation avec un dysfonctionnement mitochondrial – Ataxies Recessives

Objectifs : Le projet a pour objectif de poursuivre l'élucidation des aspects génétiques et moléculaires des ataxies récessives qui représentent un ensemble d'affections neurodégénératives sévèrement handicapantes. Les gènes d'ataxie récessive déjà identifiés, en nombre limité, suggèrent que ces maladies sont le résultat d'une perte de fonction de protéines de voies mitochondriales et/ou métaboliques, ou impliquées dans la réparation de l'ADN. Le présent projet inclut l'identification de nouveaux gènes d'ataxie récessive par l'études de liaisons génétiques et l'étude biochimique de la forme héréditaire la plus fréquente: l'ataxie de Friedreich (FRDA). Comme cette dernière est due à une perte de fonction partielle de la frataxine, une protéine mitochondriale impliquée dans la biogénèse des protéines fer-soufre (Fe-S), un accent particulier sera placé sur l'étude des ataxies récessives liées à l'altération de voies métaboliques mitochondriales et apparentées. Le projet inclut la validation et la caractérisation de partenaires protéiques potentiels de la frataxine chez les mammifères, incluant la plateforme centrale pour l'assemblage des centres Fe-S, Iscu2, la désulfurase Nfs1, l'aconitase mitochondriale Aco2 et la ferrochelatase Fech, prédits à partir de données récentes obtenues principalement à partir des orthologues de levure (sauf pour Aco2). Les mécanismes mis en jeux par les cellules de mammifères pour synthétiser et réparer les centres Fe-S seront analysés. Finalement, les protéines Fe-S non mitochondriales (à part IRP1/aconitase1) seront analysées au niveau fonctionnel.Résultats attendus : Nous espérons identifier 4 à 5 nouveaux gènes d'ataxie récessive. Nous pensons qu'au moins un de ces nouveaux gènes codera soit pour une protéine mitochondriale, soit pour une protéine impliquée dans le métabolisme du fer ou des centres Fe-S. Ce ou ces gènes seront sélectionnés pour analyse complémentaire par la construction d'un modèle souris correspondant pour tester s'ils interagissent dans la même voie que la frataxine. Nous espérons identifier et caractériser les sites de fixation de la frataxine sur ses partenaires protéiques. Ces sites représentent des pistes essentielles pour une intervention thérapeutique, par le design de petits composés frataxine-mimétiques basé sur la connaissance de la stéréochimie de ces sites et sur le rôle de la frataxine sur ces sites. Nous espérons étendre le spectre des enzymes à centre Fe-S déficientes dans l'ataxie de Friedreich et évaluer leur rôle dans la physiopathologie de la maladie.Méthodes : Les nouveaux gènes d'ataxie récessive seront localisés par cartographie par homozygotie sur les puces de génotypage Affymetrix 10K, à partir de quatre grandes familles consanguines avec des ataxies et des signes associés distincts, suggérant l'implication de quatres nouveaux gènes. Le nouveau locus d'ataxie en 6p22, que nous avons décrit précédemment, sera également inclus dans ce projet. La localisation fine de ces loci pour la recherche des gènes mutés se fera ensuite à partir de familles consanguines plus petites. L'analyse initiale des protéines mutées dans ces nouvelles formes se fera par des études bioinformatiques et phylogénétiques ainsi que par des études de localisation subcellulaire.La validation des partenaires protéiques de la frataxine, d'Iscu2 et d'Aco2 se fera par des expériences de co-immunoprécipitation in vitro et in vivo avec des anticorps produits dans le cadre de ce projet. L'identification des acides aminés de contact à la fois sur la frataxine et sur les partenaires se fera par modélisation 3D et par mutagénèse dirigée d'un acide aminé à la fois.La fonction des partenaires principaux de la frataxine, d'IscU2 et de Nfs1, sera analysée sur des cellules humaines et murines par extinction par siRNA et le phénotype cellulaire sera comparé avec notre modèle cellulaire de déficit en frataxine. Les modèles cellulaires de déficit en centre Fe-S serviront à tester si de nouveaux gènes dé