Regulation of Mammalian Enhancers by DNA methylation – REMEDY

As indicated in our initial project, we have concentrated our efforts on one model system, that of mouse ES cells (mES). It has many advantages, including the possibility of easy genetic modification by CRISPR or other methods, and the ability to perform differentiation experiments under well-controlled conditions. We studied gene expression, chromatin markers and chromatin status using genomic approaches (RNA-seq; Cut&Tag ATAC-seq). The data generated in this way form a substantial data set that we have exploited through complex bioinformatics analyses. These approaches were complemented by cell biology experiments (videomicroscopy, immunofluorescence, etc.).

Grâce au soutien apporté par l'ANR et aux personnes recrutées pour ce projet, nous avons publié 3 articles de haut niveau (Gupta et al, Nature Structural and Molecular Biology 2023; Yakhou Nucleic Acids Research 2023; Monteagudo-Sanchez et al NAR 2024), ainsi que 3 articles de revue (Yamaguchi et al, Cancers 2022; Richard Albert & Greenberg Development 2023; Monteagudo-Sanchez NSMB 2024). De plus, deux autres articles importants sont en voie d'achèvement.

Les conclusions principales de ces deux articles en cours sont:

1) Azogui et al, in prep. Nous avons identifié une nouvelle protéine qui lie l'ADN méthylé aux séquences péricentromérique de souris, ZBTB38, et dont le rôle est conservé dans de multiples espèces de vertébrés.

2) Morales-Franco et al, in prep.

Les éléments cis-régulateurs, tels que les enhancers, jouent un rôle essentiel dans la coordination des programmes d’expression génique lors des transitions cellulaires. À ce titre, des efforts considérables ont été consacrés à la caractérisation des enhancers, notamment en ce qui concerne l’accessibilité de la chromatine, les sites de liaison des facteurs de transcription (TF), les modifications post-traductionnelles (PTM) des histones et la méthylation de l’ADN en 5-cytosine (5mC). Des niveaux élevés de 5mC sont généralement corrélés à un état inactif des enhancers. Toutefois, il demeure difficile de déterminer si la 5mC empêche la liaison des TF ou si elle constitue simplement une conséquence en aval de la désactivation des enhancers. Les approches de génomique en population masquent en grande partie l’hétérogénéité cellulaire, tandis que les méthodes à cellule unique souffrent souvent d’un nombre limité de lectures par cellule.

Dans cette étude, nous avons exploité des technologies basées sur la tagmentation pour analyser simultanément les caractéristiques de la chromatine et la 5mC : Methyl-ATAC et Methyl-CUT&Tag* De plus, nous avons adapté cette approche afin d’examiner la dynamique de la 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) (hM-ATAC). Nous avons appliqué ces techniques lors de la sortie de la pluripotence naïve dans les cellules souches embryonnaires (ESC) murines, un processus qui récapitule le programme embryonnaire d’établissement de la méthylation de l’ADN. L’un des avantages de ce système est qu’il tolère l’absence complète des machineries de méthylation et de déméthylation de l’ADN.

Grâce à l’économie de ces techniques, nous avons pu obtenir des informations robustes et dynamiques, à l’échelle de la molécule unique, sur la 5mC et la 5hmC au cours de cette transition cellulaire, couvrant à la fois l’accessibilité de la chromatine et un ensemble de

Nous avons également diffusé ces résultats dans notre communauté scientifique par le biais de participation à des congrès, ainsi que par l'organisation de deux congrès internationaux (Munich-Paris Epigenetics Meeting, Munich 2023; Paris-Munich Epigenetics Meeting, Paris 2025).

The results we have obtained open up many new perspectives. Our analyses of DNA methylation and its effectors at critical phases of differentiation have revealed molecular players that could underlie various diseases, including cancers. The molecular approaches we have developed will be useful to many teams in different research contexts. Finally, we have initiated a new series of scientific meetings between the Paris and Munich scientific communities working in the field of epigenetics. The first two events (2023, 2025) were a great success. A third event is in preparation for 2027, and we hope to continue these meetings in the long term.

Cellular function depends on a precise pattern of gene expression, and alterations of this process are linked to human diseases. This pattern is determined by interactions between transcriptional regulators, regulatory elements (promoters and enhancers), and the cell’s epigenetic landscape. Three key epigenetic marks are chromatin accessibility, histone modifications, and DNA methylation. In spite of existing data, an important question that is not fully understood is the role of DNA methylation in mammalian enhancer activity. Does DNA methylation contribute directly to enhancer repression? Does it activate a subset of enhancers? What are the mechanisms underlying repression and activation? To answer these questions, we will use advanced molecular biology and genomics, in a physiological cellular system where methylation is dynamic and genetic tools available. We will also develop a new technique at single-molecule resolution to go beyond correlations and population-based assays.