Investigation of the Metabolomics Approach to evidence exposure and effects markers of Pharmaceuticals in aquatic organisms – IMAP

La métabolomique cherche à caractériser un système via la mesure simultanée de toutes les molécules présentes dans ce système et accessibles à l’analyse. Elle repose sur la génération d’empreintes chimiques sur différents sous-groupes d’échantillons et leur comparaison en vue de révéler d’éventuelles différences de concentrations de métabolites entre une population d’échantillons ‘témoins’ et une population d’échantillons ‘tests’. Les empreintes métaboliques générées par spectrométrie de masse sur des organismes du milieu aquatique sont susceptibles de refléter l’exposition par la détection directe des composés parents et de leurs métabolites dans les organismes mais également leurs effets par l’étude des perturbations physiologiques induites sur l’organisme par cette exposition chimique. Peu de données concernant les produits de biotransformation, les mécanismes d’action et d’autres effets possibles des composés pharmaceutiques sont actuellement disponibles dans la littérature. La mise en place d'une méthodologie basée sur la métabolomique par spectrométrie de masse pour compléter ces données est le défi que nous proposons de relever au cours du projet.

Les conditions et méthodes d’exposition d’un organisme modèle sauvage (la moule méditerranéenne M. galloprovincialis, couramment utilisée comme espèce bioindicateur et qui est consommée en France) ont été développées. Deux premières expositions ont été réalisées en laboratoire, une au diclofenac, substance sur la liste de vigilance de la Directive Cadre sur l’Eau et une à la venlafaxine, un anti-depresseur souvent détecté dans l’environnement. Les produits de métabolisation du diclofénac et de la venlafaxine ont pour la première fois été étudiés selon une approche non-ciblée par spectrométrie de masse haute résolution chez M. galloprovincialis. Cette approche s’est révélée puissante pour la mise en évidence de produits de métabolisation connus mais également de métabolites qui n’avaient jamais été reportés à ce jour dans la littérature pour cet organisme. Enfin l’application de la métabolomique environnementale pour la mise en évidence d’effets a démontré elle aussi son potentiel et permet de commencer à établir une représentation schématique d’Adverse Outcome Pathway du diclofénac et de la venlafaxine chez la moule méditerranéenne. Un Adverse Outcome Pathway (AOP) ou chemin de l’effet néfaste est un concept qui assemble les connaissances sur le lien entre un évènement moléculaire initiateur et une série d’évènements clés entrainant in fine un effet néfaste à un niveau biologique pertinent. La métabolomique est donc prometteuse pour mettre en évidence ce déclenchement d’évènements clés particuliers conduisant à un effet indésirable chez l'organisme entier.

Au cours de la suite du projet, les effets observés au cours de l’exposition à la venlafaxine seront comparés à ceux observés au cours de l’exposition au diclofénac afin de mettre en évidence des perturbations spécifiques du mécanismes d'action de chacun de ses deux produits pharmaceutiques ainsi que d'autres effets non liés à ce mode d’action. Le même travail sera par la suite réalisé pour une exposition à la carbamazépine (un antiépileptique). Enfin, une exposition au mélange des trois substances pharmaceutiques sera réalisée dans le but de caractériser la réponse provoquée par une exposition au mélange comparativement à celle suscitée par une exposition aux produits seuls.

Quatre articles sont publiés à ce jour :
- un article qui représente une revue de la littérature sur le diclofénac en milieu marin (occurrence à travers le monde et effets déjà documentés sur les organismes marins)
- un article correspondant à l’étude du métabolisme du diclofénac chez Mytilus galloprovinvialis
- deux article décrivant les effets observés suite à une exposition au diclofénac, le premier par une approche ciblée sur la mesure des prostaglandines (cibles du mécanisme d’action du diclofénac) et le deuxième basée sur une approche non-ciblée pour étudier les effets de façon plus globale sur le métabolisme de la moule méditerranéenne.
Deux articles sont en cours de préparation :
- un article correspondant à l’étude du métabolisme de la venlafaxine chez Mytilus galloprovinvialis par approche non-ciblée
- un article décrivant les effets moléculaireq observés suite à une exposition à la venlafaxine
De plus, 3 communications orales internationales et 2 communications orales nationales ont été réalisées à ce jour sur le projet IMAP.

The presence of pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) in the environment is known since the 70s, however, over the past decade, advances in analytical techniques has allowed for a more precise quantification of the occurrence of these substances in water, soil and biota. These molecules are considered pseudo-persistent due to their continuous release and the diffuse nature of their discharge. The development of sea outfalls wastewater treatment plant increases the pressure on the coastline. The potential impact of pharmaceuticals and their bioaccumulation in organisms of coastal environments remain relatively little studied. However, the accumulation process in organisms may be a source of vulnerability for fishing and shellfish activities. According to the molecules and the countries considered, concentrations ranging from ng/L to hundreds of ng/L in surface water, groundwater and marine waters have been reported. Despite the low levels observed, concerns regarding the risk of ecotoxicological effects of such contamination have been raised. In that context, the development of approaches to study low dose effects (particularly in the case of exposure to mixtures) constitutes a recognized challenge. Environmental metabolomics affords several advantages to answer these important questions. Particularly, when applied to ecotoxicology, metabolic fingerprints collected on aquatic organisms are likely to reflect exposure through direct detection of contaminants and their metabolites in organisms as well as effects through the study of the physiological response of the organism to the chemical exposure. In addition, exposure experiments in the laboratory may allow working on low dose and mixture exposures limiting by this way the complexity of environmental conditions. In this project, we propose to evaluate the feasibility of this approach in environmental sciences and we will assess the potential of liquid chromatography-high resolution mass spectrometry-based metabolomics to get an untargeted and multi-endpoint characterization of the metabolic disruptions induced by pharmaceuticals exposure on an aquatic organism, the Mediterranean mussel (Mytilus galloprovincialis). It is to be noted that this organism is often used as sentinel species and widely consumed as seafood. We intend to conduct this study at first on three pharmaceuticals, selected for its different mechanisms of action (MoA), as single toxicants with the view to address the potential of the metabolomics approach i) to highlight toxicant-specific perturbations linked to their known MoA as well as effects not associated with recognized molecular targets and ii) to investigate the relationship between exposure at different doses of pharmaceuticals and altered metabolic pathways. In a second phase, the metabolic response of mussels exposed to the mixture of the three pharmaceuticals will be investigated over time with the aim i) to characterize the response to the mixture comparatively to the response to single drugs and ii) to study the immediate regulation of the organism triggered by the exposures and investigate potential compensation mechanisms in the case of prolonged exposure. Finally, during this project, we will also assess the ability of metabolomics to deliver exposure biomarkers, which may constitute the starting point of future projects dedicated to water quality monitoring.