CE11 - Caractérisation des structures et relations structure-fonctions des macromolécules biologiques

Nouvelle génération de protéines fluorescentes ultrastables pour la microscopie quantitative super-résolution – STABLE-FP

Résumé de soumission

La microscopie super-résolution ("nanoscopie") a connu un développement extraordinaire ces dernières années, éclairant les sciences du vivant à l'échelle nanométrique. Notamment, la microscopie de localisation par molécules uniques (SMLM), la technique de nanoscopie la plus répandue, a élargi sa gamme d'applications pour aborder l'architecture et la dynamique des biomolécules d'une manière quantitative, en utilisant des techniques de comptage (qPALM) et de traçage individuel (sptPALM). Cependant, ces techniques ne sont pas encore matures, notamment en raison des propriétés photophysiques non idéales des marqueurs fluorescents utilisés, en particulier les protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFPs). Parce que les protéines fluorescentes (FPs) offrent un marquage codé génétiquement, les PCFPs restent cependant les marqueurs de choix pour de nombreuses applications en qPALM et sptPALM, mais restent nettement moins performant que les fluorophores organiques en termes de photostabilité. Ainsi, ce projet vise à améliorer la photostabilité des PCFPs tout en préservant, voire en améliorant, leur caractère monomérique, leur repliement et leur maturation.
Pour atteindre cet objectif, nous introduirons un changement de paradigme dans la conception des PCFPs en combinant l'étude de leur dynamique structurale dans des conditions environnementales réalistes avec leur ingénierie et criblage à haut débit à l'échelle de la molécule unique (SM). Le projet s'appuiera sur l'expertise complémentaire de notre Consortium en photophysique, microscopie de localisation et ingénierie des protéines. Le partenaire 1 étudiera les mécanismes des PCFPs en se concentrant sur des aspects dynamiques, notamment en initiant des études par RMN en plus de la cristallographie cinétique et de la spectroscopie optique. Cette vue dynamique suggérera des sites de mutation pertinents pour concevoir des PCFPs améliorées. Le partenaire 3 effectuera l’ingénierie de ces sites par évolution dirigée tandis que le partenaire 2 développera une plate-forme de criblage à haut débit compatible avec les mesures en molécules uniques (HCS-SMLM). Cela fournira un nouveau cadre, fonctionnant en boucle de rétroaction, pour la conception semi-rationnelle de PCFPs ultrastables. De plus, notre boîte à outils permettra de développer "l'ingénierie d'acquisition PALM", qui consistera à optimiser les conditions d'illumination et la composition physico-chimique des échantillons pour obtenir une photostabilité optimale des PCFPs.
Les PCFPs et les protocoles d'imagerie améliorés seront validés dans le cadre de deux applications biologiques, d'une part en neurobiologie (quantification de protéines synaptiques), et d'autre part en microbiologie (dynamique des protéines associées au nucléoïde dans la bactérie D. radiodurans).
Le projet répondra à une attente forte de la communauté, en fournissant des PCFPs photostables et de nouveaux protocoles d'acquisition de données adaptés à l'étude par qPALM et sptPALM de questions biologiques jusqu'alors peu accessibles, dans des systèmes eucaryotes et procaryotes.
Il apportera des données mécanistique clés sur le "côté obscur" des PCFPs, resté largement négligé jusqu'à présent en raison de sa complexité. Une vaste bibliothèque de variants sera générée, dont les caractéristiques seront rendues disponibles par la conception d'une base de données mise à la disposition de la communauté.
Le développement d'une plateforme innovante HCS-SMLM fournira un environnement entièrement automatisé pour le criblage des propriétés photophysiques des FPs au niveau de la molécule unique, applicable dans l'avenir à d'autres fluorophores ou questions biologiques.
En conclusion, le projet conduira notre connaissance des FPs au-delà de l'état de l'art, et rendra accessibles à la communauté des PCFPs ultrastables et de nouveaux protocoles d'acquisition, éligibles à la propriété intellectuelle.

Coordination du projet

Dominique BOURGEOIS (INSTITUT DE BIOLOGIE STRUCTURALE)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IINS INSTITUT INTERDISCIPLINAIRE DE NEUROSCIENCES
IINS INSTITUT INTERDISCIPLINAIRE DE NEUROSCIENCES
IBS INSTITUT DE BIOLOGIE STRUCTURALE

Aide de l'ANR 548 639 euros
Début et durée du projet scientifique : février 2021 - 48 Mois

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