Impact des modifications cotranslationnelles N-terminales plastidiales lors de la réponse au stress – CANMORE

Objective 1

Coordinators: Team1 (CG, France) will be the coordinator of the overall objective 1 and WP1 and WP3, whereas Team3 (IF, Germany) will be responsible for WP2.
Main methodology: structural, biochemical and in-house proteomics techniques
Objective 2

Coordinators: Team3 (IF, Germany) will be the coordinator of the overall objective 2 and WP1.
Main methodology: molecular biology, enzymology, cell-biochemistry and in-house proteomics techniques applied to in vitro and in vivo systems.
Objective 3

Coordinators: Team2 (BG, Germany) will coordinate the overall objective 3 as well as WP1 and WP2.
Main methodology: molecular biology, genetics, physiology, metabolomics, proteomics, cell biology, biochemistry, growth chambers and green house facilities

In the frame of task1 of WP1, CG team has completed the enzymatic characterization of the 3 pMetAPs, providing a detailed knowledge of enzyme properties and substrate specificity of plastid MetAPs.N-Terminomics characterization and a global quantitative proteomics of different MetAP mutant lines produced by BG team were made in CG team. On 6 biological replicates. The overall N-terminomics analysis revealed as expected that the global N-terminal acetylation was not changed in any of the MetAP mutant lines. Focusing on the N-terminal Met, 22 proteins have N-ter that were observed in two distinct forms: with or without the iMet in position 1. 14 are plastid encoded proteins. We primarly focused on the plastid encoded proteins and we checked their N-termini and relative abundance (average spectral intensity of each N-terminal form) in the different pMetAP conditions. From this analysis, we clear observed that some plastid encoded proteins are strictly dependent on one or the other MetAPs, whereas other plastid proteins are still taking in charge even when the 3 pMetAP level is low.

Summary N-terminomics for N-termini obtained in all samples:
1) NAD(P)H-quinone oxidoreductase subunit K (ATCG00430, MNSIKFPILDR/NSIKFPILDR): MetAP1C/MetAP1D
2) ATP synthase subunit beta (ATCG00480, *MRTNPTTSNPE/ TNPTTSNPEV): MetAP1B
3) 50S, L33 (ATCG00640.1, MAKGKDVRVTI/AKGKDVRVTI): MetAP1C
4) Cytochrome b6 (thylakoid membrane) petB (ATCG00720.1, MSKVYDWFEER/SKVYDWFEER): MetAP1D
5) Cytochrome b6-f- complex S4 petD (thylakoid membrane) (ATCG00730.1, MGVTKKPDLND/GVTKKPDLND): MetAP1C
6) 30S rps15 S15 (ATCG01120.1, MIKNIVISFEE/IKNIVISFEE): MetAP1C
7) RBCL (ATCG00490.1, MSPQTETKASVG/*SPQTETKASVG/ *PQTETKASVG): MetAP1C.

Summary of CG global proteome made on 4 of the 6 biological replicates:
• Proteome overall very stable in every condition
• In the double KO metap1b x metap1d + VIGS GFP:
? Increases: AT4G02520.1/AT2G02930.1; glutathione transferase; 2.3 fold change (t-test ++)
• In the double KO metap1b x metap1d:
? Increases: ATCG00720.1; Cytochrome b6; 2. 3 fold change
? Decreases: AT3G59970.3; Methylenetetrahydrofolate reductase 1; 0.4 fold change (++)
AT3G61470.1; Photosystem I chlorophyll a/b-binding protein 2; 0.4 fold change
AT3G10060.1; Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP16-4; 0.5 fold change
• In the triple KO metap1b x metap1d + VIGS MetAP1C:
? Increases: AT4G25130.1; Peptide methionine sulfoxide reductase A4; 2.1 fold change (++)
AT5G26742.3; DEAD-box ATP-dependent RNA helicase 3; 2.1 fold change (++)
AT4G23600.3; Cystine lyase CORI3; 2.6 fold change (++)
? Decreases: AT5G54270.1; Chlorophyll a-b binding protein 3; 0.5 fold change (++)
• Mostly chloroplastic proteins affected.
WP2: Characterization of plastid GNATs involved in RuBisCO acetylations
Task 1: Searching for plastid NAT(s) responsible for N-terminal RbcL acetylation
Several strategies were adopted by CG team to identify the GNAT responsible of N-terminal Proline acetylation of RbcL
From this overall characterization using combinatory investigation tools, the CG team has now gained extremely robust proofs about the characterization of the plastid GNAT responsible for NTA of RbcL Pro, strongly suggesting that GNAT7 is the major even the only one in cellulo, and to less extend also GNAT1 in vitro). GNAT 2,4,6 or 10. Are not involved.

Scientific production is underway

Les chloroplastes fonctionnent principalement comme des bioréacteurs convertissant la lumière en énergie chimique. En outre, ils agissent également en tant que centre de régulation pour la communication intracellulaire et la médiation des impacts environnementaux en régulant l'expression des gènes nucléaires. Les protéines chloroplastes sont codées par les génomes du plastide ou du noyau. Plusieurs complexes multi-protéines chloroplastiques, tels que celui de la RuBisCO (D-ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase / oxygénase - l'enzyme principale du cycle de Calvin-Benson et la protéine la plus abondante sur terre - sont assemblés à partir de sous-unités issues de chacun des deux génomes plastidique et nucléaire. Toutes les protéines localisées dans les chloroplastes, indépendamment de leur origine, subissent de nombreuses modifications co-et post-traductionnelles (CTM et PTM), qui jouent un rôle important dans la stabilité, l'accumulation, l'activité, l'assemblage et la compartimentation de ces protéines. Cependant, les CTM et les PTM des protéines plastidiques et de leurs modificateurs catalytiques n'ont pas été explorées de manière intensive à ce jour et le nombre de modifications identifiées augmente continuellement. Au cours des dernières années, la collaboration entre les trois équipes (Gif, Münster et Berlin) a conduit à une série de résultats préliminaires mettant en évidence les spécificités des systèmes de modifications N-terminales du plastide ainsi que les fonctions modulées. Ces éléments constituent les fondements du projet CANMORE.
L'objectif primordial de CANMORE est d'élucider le (s) rôle (s) des modifications N-terminales (NPM) spécifiques des plastes et leur interdépendance réglementaire avec d'autres PTM. Via trois objectifs interconnectés, nous effectuerons une caractérisation structurale et mécanistique des modificateurs plastidiques impliqués dans les NPM et les PTM associés. Une grande importance sera accordée à la maturation N-terminale non conventionnelle et énigmatique de la grande sous-unité RuBisCO. Une compréhension détaillée des modifications des protéines survenant sur RuBisCO, en particulier dans des conditions environnementales défavorables, sera nécessaire pour parvenir à une compréhension et une éventuelle amélioration future de l'activité de RuBisCO et de la photosynthèse en général. Dans ce contexte, nous fournirons une étude approfondie du N-terminome plastidique et de l'acétylome en réponse au stress thermique, qui est particulièrement important pour l'activité de RuBisCO. Collectivement, le projet CANMORE fournira non seulement une analyse complète de la machinerie du MNP plastidique, mais améliorera également considérablement notre compréhension des conséquences des MNP sur des activités plastidiques spécifiques et lors de l'évolution des conditions environnementales. Pour ce projet, une synergie d'approches complémentaires impliquant la protéomique, la biochimie, la biologie structurale, la génétique et la biologie cellulaire sera proposée. Le projet CANMORE réunira trois groupes très complémentaires [Carmela Giglione, Team1 (France); Bernhard Grimm, Team2 (Allemagne); et Iris Finkemeier, Team3, (Allemagne)] avec des intérêts et un leadership mondial à la fois dans les CTM / PTM et la physiologie des chloroplastes.