Déterminer le rôle de p53 et de ses ARN non-codants cibles dans les macrophages du tissu adipeux, dans le développement de la résistance à l'insuline – MacP53

L'objectif global du projet MacP53 est d'explorer le rôle fonctionnel de p53 dans les macrophages du tissu adipeux (MTA) des souris obèses et d'identifier les miRNAs et eRNAs régulés par p53 dans les MTA ,et qui pourraient être impliqués dans la reprogrammation des MTA induite par un challenge nutritionnel. Le projet combinera la génération et le phénotypage de modèles murins originaux permettant une invalidation spécifique de p53 dans les macrophages, ou spécifiquement dans les MTA, ainsi que des études in vitro utilisant des modèles pertinents récapitulant les caractéristiques des MTA. Pour atteindre mon objectif, le projet est divisé en deux Work Packages (WP) et quatre objectifs. Dans le WP1, je vais explorer le rôle de p53 dans les fonctions des MTA et étudier la contribution de p53 dans les MTA dans les dysfonctionnements du tissu adipeux blanc et le développement de l'insulino-résistance (IR). Pour ce faire, je vais d'abord déterminer si p53 module la polarisation ou les fonctions des macrophages métaboliquement activés, qui est le meilleur modèle in vitro disponible pour reproduire le phénotype des MTA (objectif 1). J'étudierai ensuite si l'inhibition de p53 dans les macrophages ou spécifiquement dans les MTA a un impact sur le phénotype/fonctions des MTA, les dysfonctionnements du tissu adipeux blanc , et le développement de l'IR chez les souris obèses (AIM 2). Dans le WP2, j'identifierai dans les MTA obèses, le cistrome p53 en utilisant la technique du ChIP-seq, et les miRNAs et eRNAs régulés par p53 en utilisant la technique de Global Run-On sequencing (GRO-seq) (AIM 3). Ensuite, j'étudierai les conséquences de la modulation de ces ARN non-codants spécifiquement dans les ATMs de souris obèses sur le phénotype des MTA, les dysfonctionnements du tissu adipeux blanc et le développement de l'IR.

Nous avons établi un protocole in vitro pour cultiver et polariser des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) en macrophages métaboliquement activés (MMe) qui phénocopient les macrophages du tissu adipeux obèse (MTA). Nous avons préparé les BMDM isolés à partir de souris p53MacKO (dépourvues de p53) et de leurs souris contrôles p53fl/fl. L'invalidation de p53 dans les BMDM entraine une augmentation de l'expression des gènes impliqués dans le métabolisme des lipides tels que Ppar?, Cd36 et Abca1. De plus, nous avons montré que la respiration cellulaire était augmentée dans les MMe p53KO par rapport aux cellules contrôles, suggérant une meilleure capacité oxydative. En revanche, l'activation de p53 avant la polarisation en MMe entraine une diminution de la respiration des celules.
Nous avons traité des adipocytes 3T3-L1 avec du milieu conditionné (MC) provenant de MMe contrôles ou p53KO. Par rapport au MC contrôle, le MC des MMe p53KO n'inhibe pas la phosphorylation de la PKB induite par l'insuline et ne diminue pas l'expression des gènes de signalisation de l'insuline dans les adipocytes. De plus, les adipocytes traités avec des MC provenant de MMe p53KO ont montré une augmentation de l'expression des gènes impliqués dans la lipogenèse.
Pour tester si l'invalidation de p53 dans les macrophages pourrait protéger le développement de l'IR induit par l'obésité, nous avons généré des souris invalidées pour p53 spécifiquement dans les macrophages. À l'âge de 5 semaines, les souris p53MacKO et les souris contrôles p53fl/fl ont été soumises à un régime riche en graisses et en saccharose (HF/HS-D) pendant 21 semaines pour induire l'obésité et l'IR. La prise alimentaire, la prise de poids, la répartition des graisses sont identiques pour les deux génotypes. Bien que les concentrations sériques d'insuline, de TG et de NEFA soient identiques entre les groupes, le test de tolérance au glucose a montré une amélioration de la tolérance au glucose chez les souris dépourvues de p53 dans les macrophages.
Pour tester si le silencing de p53 spécifiquement dans les MAT du tissu adipeux péri-épididymaire pourrait améliorer l'intolérance au glucose et l'IR des souris obèses adultes, nous avons profité d'une technologie basée sur des particules de glucane dérivées de la levure de boulangerie. Cette technologie permet de délivrer des siRNA et de diminuer l'expression de gènes spécifiquement dans les MTA suite à des injections intrapéritonéales chez des souris obèses, sans affecter l'expression des gènes dans les macrophages des autres organes. Après seulement 5 jours de traitement, nous avons mis en évidence une amélioration de la tolérance au glucose des souris obèses traitées avec les siRNA dirigés contre p53. De manière intéressante, nous avons observé une augmentation de l'expression des gènes impliqués dans l'absorption et le métabolisme des lipides (Trem-2, Lpl, Cd36, et Ppar?) dans les MTA après le silencing de p53.

Certaines ojectifs sont presque achevés. Bien que certaines expériences restent à faire, nous avons pu vérifier la preuve de concept selon lequel p53 contrôle la polarisation du MMe via la régulation de l'expression de gènes du métabolisme des lipides.
Nous analysons actuellement les tissus et les échantillons que nous avons collectés. Nous analysons également les données de séquençage produites dans le cadre de différentes parties du projet, qui fourniront des informations importantes pour identifier les mécanismes moléculaires impliqués.

En préparation.

L’obésité est un facteur de risque pour de nombreuses maladies métaboliques telle que l’insulinorésistance (IR) et le Diabète de Type 2 (DT2). Lors de l’obésité, l’expansion excessive du tissu adipeux (TA) blanc est accompagnée d’une accumulation de cellules immunitaires, principalement des macrophages. Les stress métaboliques qui se développent dans le TA obèse modifient le phénotype et les fonctions des macrophages du TA (MTA), entraînant une inflammation à bas bruit dans le TA et systémique.
Mes travaux, parmi d’autres, ont contribué à démontrer que l’inflammation pouvait altérer les fonctions du TA et participer au développement de l’IR. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans la reprogrammation des MTA en réponse au stress métaboliques lors de l’obésité restent méconnus. Ainsi, il serait crucial d’identifier de nouveaux acteurs et voies de signalisations modulant ces réponses pour le traitement des désordres métaboliques associés à l’obésité.
Mes résultats préliminaires montrent que l’expression du facteur de transcription p53, qui est un important intégrateur des stress cellulaires, est augmenté dans les MTA de souris obèses. De manière intéressante, cette augmentation de p53 est un évènement précoce, puisqu’elle apparait dès trois jours de régimes riche en lipides. De manière importante, nous avons montré que l’invalidation de p53 spécifiquement dans les MTA de souris obèses améliore leur tolérance au glucose. De plus, l’analyse de microarray publiés montre une augmentation de l’activation de p53 dans les MTA de patients obèses et diabétiques comparé à des patients obèses non diabétiques.
A partir de ces résultats préliminaires, j’émets l’hypothèses que l’activation de la voie p53 dans les MTA lors de l’obésité pourrait participer aux étapes précoces du développement des désordres métaboliques associés à l’obésité telle que l’IR. Par conséquent, l’objectif principal du projet MacP53 est d’explorer le rôle fonctionnel de p53 dans les macrophages et de décrypter le mode d’action de p53 en identifiant les acteurs clés du programme transcriptionnel régulé par p53 dans les MTA, et d’étudier leur rôle dans les complications métaboliques associées à l’obésité.
Ainsi, je vais 1) étudier le rôle de p53 des MTA dans les dysfonctions du TA et dans l’IR lors de l’obésité. J’utiliserai un modèle de souris permettant l’invalidation de p53 spécifiquement dans les macrophages, pour déterminer si l’invalidation de p53 dans les macrophages pourrait prévenir le développement de l’obésité et de l’IR induite par un régime riche en lipides. J’utiliserai également une technologie permettant d’invalider p53 à l’aide de siRNA spécifiquement dans les MTA de souris adultes obèses, pour déterminer si l’invalidation de p53 dans les MTA pourrait améliorer l’IR des souris obèses ; 2) identifier et étudier le rôle des acteurs clés du programme transcriptionnel de p53. J’utiliserai des techniques de pointe dont le ChIP-seq et le GRO-seq, que j’ai acquises lors de ma formation et qui ne sont pas accessibles dans de nombreux laboratoires, pour identifier les cibles transcriptionnelles directes de p53 dans les MTA. Je me concentrerai sur les micro-ARN (miR) ainsi qu’une nouvelle classe de petits ARN non-codants, les ARN dérivés des enhancers (eARN). En effet, les miR et les eARN ont été décrits comme des éléments clés du mode d’action de p53 en réponse aux stress cellulaires, en régulant de multiples voies de signalisations. Ces ARN non-codants sont des cibles très pertinentes puisqu’ils peuvent réguler l’expression de plusieurs gènes en même temps et de manière type cellulaire spécifique. Ce projet nous permettra de mieux comprendre les liens existants entre l’activation de p53, les dysfonctions du TA et l’IR, et pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles pour lutter contre l’IR.