CE13 - Biologie Cellulaire, biologie du développement et de l’évolution 

Décrypter la logique du réseau génique contrôlant la régénération extrême – RENEW

Déchiffrer la logique du réseau de régulation des gènes qui sous-tend la régénération du corps entier

La régénération varie considérablement entre mammifères (régénération réduite) avec certain organismes marins, tels que les cnidaires, capables de régénérer le corps entier (WBR). Déterminer les réseaux de régulation de gènes (GRN) qui sous-tendent la WBR chez les cnidaires est donc une approche puissante pour révéler les similitudes et les différences avec les mammifères. Néanmoins, la description de GRN d'animaux non bilatériens dotés de capacités WBR en sont à leurs balbutiements.

Objectifs - Déterminer les réseaux de régulation des gènes sous-jacents à la régénération du corps entier

Notre objectif global est de déterminer les réseaux de régulation déclenchés par une blessure et qui initient une réponse régénérative du corps entier en disséquant 1) la dynamique transcriptionnelle et 2) l'accessibilité de la chromatine à l'échelle du génome aux niveaux tissulaire et unicellulaire, afin de 3 ) déduire et 4) valider les éléments régulateurs prédits à l'aide d'approches génétiques. Cette étude est basée sur les données que nous avons obtenues au cours des dernières années et sera menée sur un modèle émergent de régénération du corps entier, le cnidaire Nematostella vectensis, développé par les membres du consortium.<br /><br />Inférer et valider les GRN de régénération du corps entier chez les cnidaires, et en particulier au niveau de la cellule unique, a jusqu'à présent été entravé par un manque de modèles appropriés et de techniques suffisamment sensibles. Nous relèverons ce défi en utilisant les approches de pointe scRNAseq et (sc)ATACseq maîtrisées par le consortium en combinaison avec un modèle émergent de régénération du corps entier cnidaire - Nematostella vectensis - dont nous sommes experts et qui convient pour disséquer génétiquement la fonction des gènes. Les objectifs spécifiques pour déterminer les GRN de régénération corps entier sont :<br /><br />1. Déterminer la dynamique transcriptionnelle et les éléments régulateurs utilisés aux niveaux tissulaire et unicellulaire.<br /><br />2. Déduire la dynamique cellulaire et les plans des GRN de régénération et les facteurs qui les contrôlent.<br /><br />3. Valider expérimentalement les éléments de base et le câblage du réseau de régulation des gènes de régénération.<br /><br />À la fin du projet, nous obtiendrons i) des cartes des éléments de chromatine accessibles au cours de la régénération du corps entier et les connexions régulatrices les liant à l'expression des gènes spécifiques à la régénération, ii) identifierons les populations cellulaires impliquées dans la régénération du corps entier processus et iii) valider fonctionnellement le sous-ensemble d'éléments régulateurs prédits au sein du GRN qui sont prédits comme étant critiques pour la régénération du corps entier. A terme, cela nous permettra de révéler les mécanismes de régulation impliqués dans l'activation d'éléments spécifiques à la régénération chez Nematostella. Ces données peuvent en outre être comparées à d'autres GRN de régénération pour comprendre la diversité des mécanismes impliqués dans ce processus et, surtout, pour mieux comprendre pourquoi certains animaux régénèrent tout leur corps alors que d'autres ne le font pas.

L'état de l'art actuel pour comprendre l'évolution de la régénération consiste à construire des réseaux de régulation des gènes (GRN) qui représentent de manière exhaustive les interactions génétiques sous-jacentes à un processus biologique, dans le but de les comparer entre les phylums pour mettre en évidence des similitudes ou identifier des éléments qui pourrait être spécifique pour induire la régénération. Plusieurs études récentes ont démontré la valeur de la réalisation d'ARN-seq (scRNA-seq) et d'ATACseq pour découvrir la diversité des types de cellules et les programmes de régulation qui sous-tendent la spécification et la différenciation des types de cellules dans les embryons entiers et les animaux. Ces approches se sont également avérées perspicaces pour comprendre la dynamique moléculaire et cellulaire lors de la régénération induite par une blessure ou une maladie chez les vertébrés.

Cependant, les approches scRNA et/ou ATAC-seq pour comprendre la régénération du corps entier ou la biologie des cellules souches chez les invertébrés marins/aquatiques en sont encore à leurs balbutiements, malgré la puissance de ces systèmes pour étudier la régénération. Chez les planaires, le RNA-seq et le scRNA-seq en vrac ont été utilisés pour créer un catalogue de types de cellules adultes et pour identifier un sous-type spécifique de cellules souches pluripotentes dont la réponse transcriptionnelle diffère au cours de l'homéostasie et de la régénération 28. Chez les acoels, une étude récente a combiné bulk RNA-seq et ATAC-seq pour proposer un GRN2 de régénération corps entier. Enfin, chez les cnidaires Nematostella et Hydra, les études scRNA-seq et ATAC-seq ont révélé une grande diversité de types cellulaires et de trajectoires de différenciation des cellules souches chez les adultes homéostatiques. Dans l'ensemble, cependant, les trajectoires de différenciation cellulaire au cours de la régénération du corps entier, ainsi que leurs GRN sous-jacents, restent largement inconnues.

Dans ce projet, nous proposons de combiner les approches ATAC-seq et scRNA-seq pour déterminer les GRN sous-jacents à l'initiation et à la dynamique cellulaire subséquente lors de la régénération de Nematostella, et pour valider expérimentalement les éléments clés à l'aide de la manipulation du génome basée sur CRISPR/Cas9. Nematostella fait partie des principaux modèles cnidaires dans lesquels ces technologies de pointe ont été établies - et les méthodes sont bien établies au sein des laboratoires des équipes coordinatrices et partenaires. Dans l'ensemble, notre consortium multidisciplinaire possède une solide expertise dans ces techniques et leurs approches analytiques et statistiques associées, ainsi que dans le modèle de recherche et ses outils fonctionnels, et nous pensons que nous sommes particulièrement bien placés pour aborder ce projet avec succès.

Nous avons sélectionné des fondateurs de FO pour des lignées transgéniques piwi et mycB étiquetées de manière endogène nous permettant de suivre leur expression (flags) et leur devenir (tag P2A::mOrange). Le génotypage de la progéniture F1 n'est pas encore concluant, mais l'analyse visuelle des animaux F1 indique que la transmission germinale du transgène peut s'être produite. Nous poursuivons actuellement leur génotypage avec des paires d'amorces optimisées ainsi que des écrans visuels pour sélectionner les animaux F1 positifs.

P1 et P2 ont optimisé les protocoles de dissociation cellulaire et d'extraction de noyaux pour produire suffisamment d'ADNg et testé une préparation de bibliothèque efficace pour le séquençage ATAC. La cartographie de la séquence obtenue se lit dans le navigateur de génome disponible, a validé notre pipeline expérimental.

P1 et P3 ont optimisé les protocoles de dissociation cellulaire et d'extraction d'ARNm unicellulaire. Un nombre suffisant de cellules et la qualité des échantillons ont été validés à l'aide de contrôles de qualité standard. En utilisant le même protocole de dissociation cellulaire, une analyse morphologique des types cellulaires à l'aide de l'AMNIS Imagstream nous a permis de commencer à développer un atlas morphologique des types cellulaires dans les polypes non coupés ainsi qu'en cours de régénération. Ces données viendront compléter les données moléculaires obtenues à partir des analyses scRNA-seq.

Nous avons embauché un étudiant en Master pour développer une base de données / UI pour miner les ressources génétiques existantes et à développer de Nematostella, dont certaines seront produites au cours du projet. Une première ébauche de la base de données est disponible sur un serveur interne et un autre étudiant en master sera embauché en 2023 pour finaliser cette base de données et la rendre accessible au public.

Enfin, et avec le soutien de l'IDEX UCAjedi, nous avons développé de nouvelles activités de sensibilisation avec l'artiste Irene Kopelman, qui a effectué sa résidence en partie dans l'équipe des coordinateurs de l'IRCAN et qui a travaillé sur un projet intitulé - si nous devions regarder la régénération avec un œil différent -. En effet, vers la fin de la résidence, un atelier de 2 semaines a été organisé au Musée contemporain de Nice, France (MAMAC), permettant aux élèves et au grand public artistique de s'initier à la régénération du corps entier chez les organismes marins. Une exposition d'art de 6 mois débutera en septembre 2022 mettant en vedette la capacité de régénération de Nematostella vectensis.

Le présent projet nous permettra d'acquérir des connaissances sans précédent sur les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la régénération du corps entier chez Nematostella et de fournir des informations importantes pour accroître notre compréhension de l'évolution de ce processus à travers les métazoaires. Une comparaison systématique des GRN déployés lors de la régénération à travers des modèles de régénération du corps entier nous permettra finalement d'identifier un «noyau de régénération«, c'est-à-dire un module GRN minimal requis et suffisant pour déclencher une réponse régénérative. De plus, la comparaison de ces données avec des modèles moins régénératifs peut fournir de nouvelles informations sur les raisons pour lesquelles certains organismes possèdent cette capacité fascinante alors que d'autres ne le font pas.

Les données générées par le présent projet seront publiées dans des revues internationales à comité de lecture de premier plan, sélectionnées pour maximiser l'impact scientifique de nos résultats, et favorisant les publications en libre accès le cas échéant. Enfin, nous prévoyons de rendre nos données scRNA-seq facilement accessibles à la communauté scientifique dès la publication de nos résultats via une base de données en ligne librement accessible, ainsi que le dépôt standard dans des référentiels scientifiques accessibles au public.

1. Röttinger, E. Nematostella vectensis, an Emerging Model for Deciphering the Molecular and Cellular Mechanisms Underlying Whole-Body Regeneration. Cells 2021, 10, 2692. doi.org/10.3390/cells10102692

2. Croce O, Röttinger E. Creating a User-Friendly and Open-Access Gene Expression Database for Comparing Embryonic Development and Regeneration in Nematostella vectensis. Methods Mol Biol. 2022;2450:649-662.

Dans notre projet, nous déterminerons les réseaux de régulation géniques (GRN) déclenchés par une blessure et qui contrôlent la régénération du corps entier en disséquant 1) la dynamique transcriptionnelle et 2) l'accessibilité de la chromatine à l'échelle du génome aux niveaux des tissus et des cellules. Nous allons également 3) inférer et 4) valider les trajectoires cellulaires et les éléments régulateurs à l'aide d'approches génétiques. Cette étude est basée sur les données obtenues dans le laboratoire au cours des cinq dernières années et sera menée sur le nouveau modèle de régénération du corps entier - l'anémone de mer Nematostella vectensis (Cnidaria, Anthozoa) - développé et maîtrisé par le laboratoire.
Après une blessure, la capacité de régénération varie considérablement des mammifères, à régénération limitée, aux organismes aquatiques, ayant la capacité de régénérer leur corps entier, tels que les cnidaires. Il est donc nécessaire de déterminer les réseaux de régulation des gènes sous-jacents à la régénération du corps entier afin de révéler les similitudes et en particulier les différences avec les mammifères. Pourtant, les GRN de régénération, en particulier d'invertébrés marins, ayant des capacités de régénération du corps entier tels que les cnidaires, sont à leurs balbutiements.
Jusqu'à présent, établir les GRNs contrôlant la régénération du corps entier chez les cnidaires, en particulier au niveau des cellules uniques, a été entravé par le manque de modèles appropriés et de techniques suffisamment sensibles. Nous sommes convaincues que cela est désormais possible en utilisant les approches de pointe scRNAseq et (sc)ATACseq maîtrisées par le consortium en combinaison avec Nematostella, un modèle cnidaire de régénération du corps entier que nous maîtrisons au laboratoire et qui convient pour disséquer génétiquement la fonction des gènes.
Afin de déterminer les GRNs sous-jacents à la régénération du corps entier chez Nematostella, nous avons trois objectifs spécifiques :
1. Déterminer la dynamique transcriptionnelle et les éléments régulateurs actifs aux niveaux tissulaire et unicellulaire en utilisant les approches scRNA-seq et ATAC-seq.
2. Déduire la dynamique cellulaire, les interactions géniques des GRNs de régénération ainsi que les facteurs qui les contrôlent en utilisant une reconstruction de trajectoire cellulaire et une analyse d'enrichissement de motif.
3. Valider expérimentalement les éléments centraux et les interactions géniques des GRNs de régénération en testant les éléments activateurs spécifiques à la régénération et en utilisant des approches fonctionnelles gène-spécifiques à l'aide de la technologie CRISPR / Cas9.
Ces objectifs nous permettront de révéler la dynamique cellulaire précise, tels que les trajectoires des cellules souches en réponse à la blessure, ainsi que les mécanismes de régulation sous-jacents impliqués dans l'activation des modules centraux spécifiques à la régénération. Ceci est crucial lors des études sur l’évolution / comparatives afin de mieux comprendre pourquoi certains animaux régénèrent alors que d'autres ne le font pas (ou en font de manière limitée). De plus, cette étude intégrative est essentielle pour développer des approches biomédicales permettant l’initiation de programmes régénératifs dans les organes ou les tissus ayant perdu cette capacité au cours de l'évolution ou au cours du vieillissement.

Coordination du projet

Eric ROTTINGER (Institut de Recherche sur le Cancer et le Vieillissement, Nice)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IRCAN_SS Institut de Recherche sur le Cancer et le Vieillissement, Nice
IRCAN_ER Institut de Recherche sur le Cancer et le Vieillissement, Nice
IPMC_PB Institut de pharmacologie moléculaire et cellulaire
CGR_ASP Centre for Genomic Regulation / Centre for Genomic Regulation

Aide de l'ANR 653 041 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2020 - 48 Mois

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