Elucider le mécanisme d'action du système de sécrétion de type IX (T9SS) – T9-Mechanism

Nous utilisons des nanobodies dirigés contre les domaines solubles de GldL et GldM pour purifier le complexe membranaire endogène directement à partir des membranes de Flavobacterium johnsoniae. Après solubilisation des membranes, le complexe est purifié par chromatographie d'affinité au nickel (grâce à l'His-tag fusionné aux nanobodies) et par gel filtration, et les fractions récupérés sont analysées par microscopie électronique à coloration négative. Concernant la purification du complexe GldKN endogène, nous n'avons pas pu obtenir de nanobodies dirigés contre ces protéines. Nous utilisons donc une souche mutante de F. johnsoniae qui exprime la protéine GldK fusionnée au tag ALFA (Götzke et al., 2019), et nous allons purifier le complexe en utilisant un nanobody dirigé contre ce tag.

- Nous avons résolu la structure cristalline de la protéine PorN et nous avons analysé la fonction de ces différents domaines.
- Nous avons analysé le mécanisme d'action du moteur GldLM, révélant le rôle de la force proton-motrice, des résidus basiques critiques situes dans les hélices transmembranaires, et des changements conformationnels énergie-dépendants.
- Nous avons démontré que la protéine PorW sert de lien entre les anneaux PorKN et le translocon Sov.

L'analyse par électrophorèse en condition native des différentes fractions du complexe GldLM purifié a révélé la présence du Complexe Alternatif III. En effet, ce complexe membranaire est purifié à partir des membranes de Flavobacterium johnsoniae grâce à son interaction opportuniste avec le nickel (Sun et al., 2018). Par conséquent, nous allons dorénavant produire les nanobodies fusionnés à un Strep-tag au lieu d'un His-tag.

1. Fuchsbauer O, Lunar Silva I, Cascales E, Roussel A, Leone P. (2022) Structural and functional analyses of the Porphyromonas gingivalis type IX secretion system PorN protein. J Biol Chem. 298:101618.
2. Vincent MS, Comas Hervada C, Sebban-Kreuzer C, Le Guenno H, Chabalier M, Kosta A, Guerlesquin F, Mignot T, McBride MJ, Cascales E, Doan T. (2022) Dynamic proton-dependent motors power type IX secretion and gliding motility in Flavobacterium. PLoS Biol. 20:e3001443.
3. Gorasia DG, Lunar Silva I, Butler CA, Chabalier M, Doan T, Cascales E, Veith PD, Reynolds EC. (2022) Protein interactome analysis of the type IX secretion system identifies PorW as the missing link between the PorK/N ring complex and the Sov translocon. Microbiol Spectr. 10:e0160221.
4. Song L, Perpich JD, Wu C, Doan T, Nowakowska Z, Potempa J, Christie PJ, Cascales E, Lamont RJ, Hu B. (2022) A unique bacterial secretion machinery with multiple secretion centers. Proc Natl Acad Sci U S A. 119:e2119907119.

L’objectif de ce projet est de décrypter le mécanisme d’action du système de sécrétion de type IX (T9SS) qui a été découvert récemment. Le T9SS est responsable de la pathogénicité de P. gingivalis en permettant la sécrétion de facteurs de virulence, et de la motilité de F. johnsoniae en permettant la sécrétion d’adhésines. Parmi les 18 protéines essentielles à la fonction du T9SS, les protéines K-L-M-N forment probablement un complexe central. Nous proposons que le complexe de membrane externe K-N en forme d’anneau sert de plateforme d’interaction pour recruter le complexe de membrane interne L-M, et que ce complexe L-M est un nouveau moteur moléculaire utilisant la force proton-motrice. Nous allons mettre en place une étude des relations structure-fonction du T9SS : résolution des structures des différentes protéines (K, L et N) et complexes membranaires (K-N, L-M et K-L-M-N) par cristallographie et cryo-microscopie électronique, et étude fonctionnelle du complexe L-M in vivo.