CE29 - Chimie : analyse, théorie, modélisation

Imagerie multimodale combinant la spectroscopie Raman et la spectrométrie de masse appliquée à la tuberculose – MultiRaMaS

Imagerie multimodale combinant la diffusion Raman et la spectrométrie de masse appliquée à la tuberculose (MultiRaMaS).

Dans un contexte de santé public, face à des résultats d’imagerie conventionnelle souvent décevants, l’imagerie multimodale devient une réelle alternative. Diverses techniques d'imagerie renseignent sur les groupes fonctionnels, les poids moléculaires ou les sites de reconnaissances spécifiques, mais aucune technique individuelle ne permet de répondre de manière optimale à toutes les questions. Il est donc attractif de combiner des informations provenant de deux plateformes analytiques ou plus.

Enjeux et objectifs de MultiRaMaS.

D'une part, en tant que stratégie émergente et ambitieuse, l'imagerie multimodale combinant la spectroscopie Raman (RS) et la désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) nécessite des améliorations: 1) optimisation d’une méticuleuse et commune préparation des échantillons (cryo-section, identification précise des structures anatomiques), 2) optimisation des paramètres pour une imagerie multi-omiques rapide par RS, 3) optimisation des paramètres pour accéder aux spécificités chimiques et structurales par MALDI, 4) quantification des biomolécules d'intérêt par MALDI, et 5 ) le traitement de données (visualisation, quantification, superposition et fusion des données d'imagerie hyperspectrale). D'autre part, les résultats méthodologiques seront appliqués pour la première fois à la caractérisation de la tuberculose (TB), une maladie infectieuse qui affecte chaque année 10 millions d’êtres humains et cause 1,7 million de décès. Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agent étiologique de TB, établit une infection pulmonaire durable dans les lésions complexes. Afin de lever les verrous scientifiques, nos efforts actuels sont axés sur l’augmentation de la résolution spatiale pour visualiser et identifier les biomolécules d’intérêt aux niveaux cellulaire et subcellulaire. La cartographie et la quantification des médicaments antituberculeux et des biomarqueurs dans le phagolysosome des macrophages où résident les bacilles de Mtb sont primordiales. Ainsi, les principaux objectifs biologiques sont : 1) déchiffrer l’architecture et le microenvironnement des lésions tuberculeuses, 2) cartographier, identifier et quantifier les médicaments antituberculeux et les biomarqueurs dans le phagolysosome des macrophages, et enfin 3) évaluer l’effet sur Mtb de la concentration en antituberculeux et de la durée du traitement.

Pour atteindre les objectifs stratégiques, MultiRaMaS est organisé en 5 tâches :
- Tâche 1 «Préparation des échantillons« : Celle-ci consiste à utiliser des poumons de souris et lapin infectés par la tuberculose et traités avec un panel d’antibiotiques. Une fois les poumons collectés, ils seront sectionnés. Les coupes seront déposées sur un support adapté aux deux modalités. Cette étape inclura une phase de validation afin de vérifier l’intégrité des coupes, ainsi que définir les régions anatomiques à imager. Les protocoles de coloration histologique seront également inclus dans cette tâche.
- A noter, qu’afin de réaliser des acquisitions au sein des mêmes régions anatomiques et faciliter l’alignement des deux modalités un marquage fiduciaire sera utilisé.
- Tâche 2 «Imagerie Raman« : Celle-ci se focalisera essentiellement sur l’optimisation des paramètres Raman afin de déterminer les conditions optimales d’acquisitions des images.
- Tâche 3 «Imagerie par spectrométrie de masse MALDI« : Afin de réaliser une étude multi-omique, plusieurs approches seront envisagées. L’idée étant de pouvoir détecter et imager, à partir d’une préparation adéquate des échantillons, toutes les biomolécules liées à la tuberculose à savoir les antibiotiques, les lipides, et les peptides/protéines. De la même façon, les paramètres d’acquisitions seront également optimisés.
- Tâche 4 «Quantification par imagerie MALDI« : Celle-ci est directement liée aux développements et résultats obtenus dans la précédente tâche. La quantification des antibiotiques et des lipides recevra une attention particulière.
- Tâche 5 «Traitement des données d’imagerie multimodale« : Celle-ci concerne la mise en place d’une stratégie computationnelle dédiée à l’imagerie multimodale. Dans ce but, un nouveau logiciel sera conçu regroupant les fonctionnalités basiques relatives aux modalités, ainsi que des fonctionnalités plus avancées permettant la corrélation des deux modalités ainsi que leur fusion.
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Les résultats obtenus lors de cette première période sont en accord avec ce qui était attendu dans le projet MultiRaMaS. Les optimisations faites dans le cadre de la première tâche ont permis d’en finaliser les contours. La méthodologie est dorénavant maitrisé et robuste. Les marquages fiduciaires en forme de croix ont été optimisés à l’aide du faisceau laser et sont maintenant utilisés en routine, facilitant ainsi la superposition des images multimodales. Concernant la deuxième tâche, peu de résultats ont été généré en spectroscopie Raman. Cependant, certains développements ont été effectués et les résultats préliminaires ont permis de réaliser des avancées intéressantes sur l’optimisation des paramètres d’acquisition des images. La troisième tâche se focalise quant à elle sur les développements en imagerie par spectrométrie de masse MALDI en vue d’une étude multi-omique. Pour cela différentes matrices et conditions de dépôt ont été réalisés. Les meilleures conditions ont été appliquées pour étudier dans un premier temps la distribution spatiale à 5 µm de la chlofazimine (CFZ) dans la zone du granulome. Il a été montré que la CFZ était localisée dans les macrophages et les macrophages spumeux. Certains lipides liés à la tuberculose, en particulier les PIM, ont également été cartographiés. Basé sur les précédents résultats, la quantification par imagerie MALDI (qMSI) a été initié sur la CFZ. Ce développement repose sur l’utilisation d’un homogénat de tissu et l’élaboration d’une droite de calibration qui servira à déterminer la concentration de CFZ. La qMSI sera alors comparée avec les résultats de microdissection laser suivie d’une quantification par chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse. Pour finir, le traitement des données d’imagerie s’effectue actuellement avec des outils préexistants. Cette cinquième tâche sera amorcée très prochainement et devrait aboutir à la conception d’un nouveau logiciel dédié au traitement de l’imagerie multimodale.

Dans les prochaines échéances, nous avons pour ambition de poursuivre nos efforts afin de mener à bien ce projet MultiRaMaS. Nous nous focaliserons dans un premier temps sur la finalisation de la méthode qMSI ainsi que sa publication dans un journal à comité de lecture. Comme décrit précédemment, l’idée est de pouvoir réaliser une étude multi-omique par imagerie MALDI, nous poursuivrons donc nos efforts sur la détection et la cartographie des antibiotiques orienté contre TB ainsi que des lipides. Nous nous focaliserons par la suite sur le développement de l’imagerie MALDI pour la détection des peptides / protéines. Une fois les développements méthodologiques liés à l’imagerie MALDI finalisés, l’imagerie multimodale sera mise à l’honneur. En parallèle, l’écriture du nouveau logiciel aura été amorcé et devrait nous permettre une automatisation du traitement des images multimodales facilitant ainsi l’interprétation des résultats. Nous avons également pour ambition d’élargir notre panel de modalités à implémenter afin d’enrichir significativement notre connaissance de cette pathologie infectieuse.

M. Tuck, L. Blanc, R. Touti, N.H. Patterson, S. Van Nuffel, S. Villette, J.-C. Taveau, A. Römpp, A. Brunelle, S. Lecomte, N. Desbenoit. Multimodal Imaging based on Vibrational Spectroscopies and Mass Spectrometry Imaging applied to Biological Tissue: A Multiscale and Multi-omics Review. Analytical Chemistry, 2021, 93, 445-477. DOI: 10.1021/acs.analchem.0c04595. (https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-03107524v1). Invitation de N. Desbenoit à rédiger une revue.

L. Blanc, A. Brunelle, C. Courrèges, N. Desbenoit, I. Fournier, J. Franck, L. Labeyrie, S. Mounicou, J.-Y. Salpin, D. Schaumlöffel, M.A. Subirana, D. Touboul, M.D. Tuck, S. Van Nuffel, et M. Wisztorski (par ordre alphabétique). Imagerie par Spectrométrie de Masse : Principes et Applications. ISTE, Encyclopédie Science, 2021, Chimie Analytique, Chapitre XXX, Soumis et accepté. Invitation de N. Desbenoit à rédiger un chapitre.

Dans un contexte de santé public, face à des résultats d’imagerie conventionnelle souvent décevants, l’imagerie moléculaire multimodale devient une réelle alternative. Diverses techniques d'imagerie renseignent sur les groupes fonctionnels, les poids moléculaires ou les sites de reconnaissances spécifiques, mais aucune technique individuelle ne permet de répondre de manière optimale à toutes les questions. Il est donc très attractif de combiner des informations provenant de deux plates-formes analytiques ou plus. Une telle approche est requise pour élucider la complexité d’un tissu, ouvrant la voie à une imagerie multi-omique qui permet notamment la caractérisation qualitative et quantitative ciblée ou sans a priori de lipides, protéines, peptides, antibiotiques, acides nucléiques et glycanes. Le projet associe la diffusion Raman (RS) à la spectrométrie de masse en une approche unique via une seule coupe de tissu. Les forces et faiblesses de ces technologies les rendent fortement complémentaires. Les objectifs clés de MultiRaMaS sont à la fois méthodologiques et biologiques. D'une part, en tant que stratégie émergente et ambitieuse, l'imagerie multimodale combinant RS et la désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) nécessite des améliorations: 1) optimisation d’une méticuleuse et commune préparation des échantillons (cryo-section, identification précise des structures anatomiques), 2) optimisation des paramètres pour une imagerie multi-omiques rapide par RS, 3) optimisation des paramètres pour accéder aux spécificités chimiques et structurales par MALDI, 4) quantification des biomolécules d'intérêt par MALDI, et 5 ) le traitement de données (visualisation, quantification, superposition et fusion des données d'imagerie hyperspectrale). D'autre part, les résultats méthodologiques seront appliqués pour la première fois à la caractérisation de la tuberculose (TB), une maladie infectieuse qui affecte chaque année 10 millions d’êtres humains et cause 1,7 million de décès. Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agent étiologique de TB, établit une infection pulmonaire durable dans les lésions complexes. Afin de lever les verrous scientifiques, nos efforts actuels sont axés sur l’augmentation de la résolution spatiale pour visualiser et identifier les biomolécules d’intérêt aux niveaux cellulaire et subcellulaire. La cartographie et la quantification des médicaments antituberculeux et des biomarqueurs dans le phagolysosome des macrophages où résident les bacilles de Mtb sont primordiales. Ainsi, les principaux objectifs biologiques sont : 1) déchiffrer l’architecture et le microenvironnement des lésions tuberculeuses, 2) cartographier, identifier et quantifier les médicaments antituberculeux et les biomarqueurs dans le phagolysosome des macrophages, et enfin 3) évaluer l’effet sur Mtb de la concentration en antituberculeux et de la durée du traitement. Tel un objectif ultime, toutes les données d'imagerie seront utilisées pour appliquer l’intelligence artificielle et le machine learning afin d’automatiser la superposition de données d'imagerie sur des images histologiques numérisées et entièrement annotées. Pour atteindre les objectifs stratégiques, MultiRaMaS est organisé en 5 tâches. Les expériences MALDI-MSI doivent s'appuyer sur une combinaison hautement performante d'une source à haute résolution spatiale et d'un spectromètre de masse haute résolution combinant grande précision et capacité MS/MS. Ce projet rassemble les compétences complémentaires du coordinateur et de ses collaborateurs de renom pour assurer le développement d’une approche d’imagerie multimodale destiné à la recherche sur la tuberculose. Les ressources et des expertises complémentaires sont réunies pour garantir la faisabilité du programme scientifique proposé. Ce projet multidisciplinaire et interdisciplinaire est original par les technologies mises en œuvre qui ont rarement été combinées, ainsi que par ses applications pour la recherche sur la TB.

Coordinateur du projet

Monsieur Nicolas Desbenoit (INSTITUT DE CHIMIE ET DE BIOLOGIE DES MEMBRANES ET DES NANOOBJETS)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CBMN INSTITUT DE CHIMIE ET DE BIOLOGIE DES MEMBRANES ET DES NANOOBJETS

Aide de l'ANR 247 708 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2019 - 42 Mois

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