Intégration du métabolisme microbien dans la chimie des nuages : des "omiques" au modèle – METACLOUD

Task 1 : Sampling and characterization of cloud water (ICCF, LaMP)
Il s'agit de collecter de l'eau de nuage au sommet du puy de Dôme, observatoire internationalement reconnu. Pour cela il faut prélever une quantité très importante d'eau de nuage, ce qui implique le développement et la fabrication d'impacteurs haut volume. Il faut caractériser chimiquement et biologiquement cette eau de nuage (chimie analytique et biologie moléculaire).
Task 2 : Incubations and préparation of cellular extracts (ICCF, LaMP).
Après filtration tangentielle pour concentrer la biomasse, les échantillons sont incubés dans des microcosmes mimant au mieux deux conditions atmosphériques contrastées ( lumière+H2O2 17°C pour le jour; noir , pas d'H2O2, 5°C pour la nuit) en milieu nuage artificiel contenant du formaldéhyde. Pour cela des photo-bioréacteurs doivent être construits. Après incubation, des extraits cellulaires sont réalisés pour obtenir des métabolites ou des ARNm qui seront analysés dans les taches 3 et 4.
Task 3 : Metametabolomics and Metatranscriptomics (ICCF, GMGM)
Les métabolites extraits des microorganismes générés dans la tache 2 seront analysés par spectrométrie de masse par une approche métabolomique. Les ARN messagers seront analysés par bio-informatique par une approche de transcripiomique.Ces études permettront de mettre en évidence la modulation des voies métaboliques induite par les deux scénarios atmosphériques.
Task 3 : Metafluxomis (LISBP)
Pour cette tache les incubations en microcosmes seront réalisées avec du formaldéhyde enrichi en 13C. Les analyses par RMN et MS des différents isotopomères présents dans les extraits microbiens permettront de tracer les voies métaboliques empruntées et de mesurer les vitesses de transformation des différents intermédiaires de ces voies (approche par fluxomique).
Task 4:Modeling (LaMP, LISBP)
Les voies métaboliques correspondant à la bio-transformation du formaldéhyde seront intégrées dans un modèle de chimie atmosphérique (CLEPS). Plusieurs scenarios seront pris en compte pour paramétrer le modèle avec des taux de transformations déterminés dans la tâche 3.

Task 1 : Sampling and characterization of cloud water
• Construction de 5 impacteurs à nuage. Trois étaient déjà opérationnels, deux nouveaux le sont maintenant (non prévu initialement).
• Utilisation d’un collecteur de pluie haut volume et première collecte de pluie (non prévu initialement).
• Collecte de la phase aérosol ; le nombre de microorganismes collectés s’est révélé trop faible malgré les volumes d’air échantillonnés, cette approche sera abandonnée (non prévu initialement).
• Collecte de la phase aqueuse des nuage/ plusieurs tentatives à l’automne 2021, non fructueuses. La période de novembre 2021 devrait permettre la collecte d’un échantillon haut volume.
Task 2 : Incubations and preparation of cellular extracts
• Achat et installation d’un appareil de centrifugation tangentiel (prévu), maintenant opérationnel, essai sur échantillons de pluie et d’aérosols. Le facteur de concentration cellulaire est de 3 à 4 fois (également un échange du milieu naturel par milieu artificiel).
• Construction de 26 photo-bioréacteurs pour les incubations en microcosmes (prévu).
• Mise en place et optimisation d’un protocole pour l’incubation en microcosmes d’un consortium de souches microbiennes dans les deux conditions atmosphériques contrastées (jour d’été, lumière, H2O2, 17°C vs nuit d’hiver, sans lumière ni, H2O2 5°C). L’idée est de remplacer pour cette étape d’optimisation, la microflore d’un nuage réel, difficile à obtenir pendant la période de la COVID, par un consortium ‘synthétique’ composé de 4 bactéries (2 Pseudomonas, 1 Sphingomonas, 1 Rhodococcus) et 1 levure (Dioszegia). Ces souches ont été isolées des nuages au site du Puy du Dôme et sont caractéristiques de ce milieu. Les souches ont été étudiées séparément puis en consortium, les vitesses de dégradation de H2O2 et du formaldéhyde ont pu être mesurées, les temps d’incubation optimaux pour les prélèvements nécessaires aux taches 3 et 4 (« omiques ») sont donc déterminés.
• L’étude approfondie de ces souches a permis de caractériser le génome de la levure Dioszegia, genre très peu décrit dans la littérature (non prévu).
Task 3 : Metametabolomics and Metatranscriptomics
• En l’absence d’échantillons de nuage, des analyses non ciblées par LC-MS du métabolome (non prévues initialement) ont dû être réalisées sur des échantillons de pluie et de cellules microbiennes (individuelles et consortium) pour évaluer le seuil de sensibilité de détection des métabolites (établi à 10x8 cellules extraites).
• L’étude du seuil de sensibilité pour l’extraction des ARNm des cellules microbiennes est en cours (non prévu initialement).
Task 4: Metafluxomics
• Les mêmes échantillons (extraits de pluie et de souches microbiennes) ont été analysés avec succès par LC-MS de manière ciblée (acides aminés, sucres, intermédiaire du métabolisme central). Des analyses par RMN ont également été tentées (non prévues initialement). La concentration des métabolites semble cependant trop faible pour cette technique.

Nous avons été confrontés à de nombreuses difficultés liées au COVID19. En effet nous n’avons pas pu réaliser d’expériences en laboratoire pendant de nombreux mois ; l’accès au site du puy de Dôme pour les prélèvements était lui aussi impossible. D’autre part, nous avons eu dû faire face récemment à un problème de délai pour la fabrication de deux des impacteurs à nuage, ce qui a reporté les prélèvements haut volume initialement prévus. Toutes nos expériences (incubations, méta-métabolomique, méta-fluxomique et méta-transcriptomique) étant basées initialement sur ces prélèvements de nuages, nous avons révisé en profondeur notre projet et démarré des voies de recherche alternatives. L’idée est de garder la structure du projet avec les différents work packages, de travailler avec une biomasse microbienne représentative de l’atmosphère, et de changer la nature des échantillons :

1) Echantillons atmosphériques : Nous avons développé des techniques de collecte haut volume d’échantillons atmosphériques naturels : aérosols et pluie.
2) Consortium de souches microbiennes (4 bactéries et 1 levure) isolées des nuages : nous avons mis au point les protocoles d’incubation en microcosme.
Pour ces deux types d’échantillons nous avons testé les limites de détection des métabolites intracellulaires par LC-MS et RMN.
Ces approches alternatives, notamment avec un consortium de souches, constituent notre plan B au cas où nous n’arriverions pas à collecter des nuages dans un délai compatible avec le timing du projet. Nous avons prévu une campagne de collecte en novembre/décembre 2021 ; les conditions étant propices aux prélèvements et n’ayant plus de contraintes liées au COVID. Nous avons conscience du retard pris mais nous arrivons dans des conditions optimales pour la collecte haut volume de nuage ; toutefois, le projet pourra basculer sur le plan B, notamment avec les souches en cas d’échec sur les prélèvements nuage.

International
Revues à comité de lecture Article commun ICCF et GMGM, en collaboration avec le DOE Joint Genome Institute : F. Bringel, D. Jarrige, L. Eck, S. Haridas, M. Joly, J.M. Vyskocil, T. Nadalig, S. Vuilleumier, I. Grigoriev, P. Amato, A.M. Delort. A high-quality genome assembly of the cloud isolated basidiomycetous Dioszegia hungarica PDD-24b-2.
Communications (conférence) 1. J.M. Vyskocil, M. Joly, P. Amato, F. Rossi, C. Jousse, L. Deguillaume, A.M. Delort (ICCF +LaMP). Meta-Omics Analyses Of Cloud Microbial Metabolism Of C1 Compounds. European Meeting on Environmental Chemistry (EMEC21), 30 Nov –3 Dec 2021, Novi Sad, Serbia.

France

Communications (conférence) 1. F. Bringel, Y. Louhichi, T. Nadalig, S. Vuilleumier, J.-C. Portais, L. Deguillaume, P. Amato, A.M. Delort. (présentation poster) Metatranscriptomic exploration of the role of methylotrophic microbial communities in cloud chemistry. Journée métatranscriptomique complexe: de la dual transcriptomique à la métatranscriptomique: challenges et perspectives”, Nancy France 10 décembre 2019

Actions de diffusion
Articles de vulgarisation
1. A.M. Delort et L. Deguillaume (ICCF + LaMP)
« Dans l'intimité des nuages »,
Sciences et Avenir, sept 2021, N° 895.
2. Sixième Sciences : shows.acast.com/sixieme-science/episodes/ce-laboratoire-unique-au-monde-analyse-les-nuages
3. L. Deguillaume : Article INSU CNRS www.insu.cnrs.fr/fr/cnrsinfo/150-ans-de-lopgc-150-ans-de-donnees-sur-le-climat



Liste des publications monopartenaires (impliquant un seul partenaire)
International
Revues à comité de lecture 1. Millard P, Sokol S, Kohlstedt M, Wittmann C, Létisse F, Lippens G, Portais JC. IsoSolve: An Integrative Framework to Improve Isotopic Coverage and Consolidate Isotopic Measurements by Mass Spectrometry and/or Nuclear Magnetic Resonance. Anal Chem. 2021 Jul 13;93(27):9428-9436. doi: 10.1021/acs.analchem.1c01064.

Communications (conférence)
1. A.M. DELORT (conférence invitée) « The cloud microbiota:
Microorganisms - H2O2 interactions »
2. From Interactions To Global Environmental Challenges, Israel's Microbial Ecology Meeting (Visioconference), 26-28 avril 2021.
4. A.M. DELORT (conference invitée) « The cloud microbiota: Microorganisms - H2O2 interactions »
5. European Meeting on Environmental Chemistry (EMEC21), 30 Nov –3 Dec 2021, Novi Sad, Serbia.

France

Communications (conférence)
1. AM DELORT, ICCF (conférence invitée) « Quel rôle des microorganismes dans la chimie des nuages ? le cas de H2O2. »
Atelier LEFE-AEROCLIM, 20-22 octobre 2021, Lille

Actions de diffusion Articles de vulgarisation
1. A.M. Delort, ICCF, « La chimie des nuages » dans le Livre « Etonnante chimie », CNRS éditions (EAN13 : 9782271136527), avril 2021.
2. Conférences de vulgarisation 1. A.M. Delort, ICCF, Présentation du livre « Etonnante chimie », 29 sept 2021, Maison de la chimie, Paris

Les nuages sont des acteurs majeurs de la chimie atmosphérique. Ce sont des milieux complexes et multiphasiques (gaz/eau/particules). Depuis la dernière décennie, des progrès considérables ont été faits dans la compréhension du fonctionnement de ces systèmes, avec notamment la découverte de communautés microbiennes métaboliquement actives pouvant contribuer potentiellement à la transformation de la matière organique. Cependant, la chimie atmosphérique nocturne reste mal connue alors que l’activité biologique pourrait jouer un rôle important pendant cette période. Ce rôle reste à être pris en compte dans des modèles numériques de chimie des nuages. A ce jour, aucun modèle n’intègre de mécanisme biologique.

L’objectif de METACLOUD est donc d’améliorer la connaissance fondamentale du système nuageux, sur le plan chimique et biologique, et plus spécifiquement d’évaluer le rôle potentiel du métabolisme microbien dans la chimie des composés à un atome de carbone (C1), particulièrement la nuit. Ceci sera réalisé grâce à : i) l’obtention de données nouvelles et précises des réseaux métaboliques du microbiome du nuage et de leurs modulations face à des scénarios atmosphériques contrastés, en particulier de cartes de « méta-fluxome » qui donnent une image dynamique du système ; ii) l’intégration de ce nouveau savoir, en particulier des vitesses de biodégradation des composés en C1, dans un nouveau modèle de chimie atmosphérique.

Ce projet est focalisé sur les composés en C1 car ils sont les produits terminaux majeurs de la chimie radicalaire, et plus particulièrement sur le formaldéhyde qui est fortement concentré dans les nuages (microM) et qui est à l’intersection de différentes voies métaboliques des microorganismes méthylotrophes.

Des volumes importants d’eau nuageuse seront collectés à l’observatoire du puy de Dôme, site labellisé GAW, grâce à des collecteurs à nuage acquis en 2018. Les microorganismes endogènes seront concentrés par filtration tangentielle. Le contenu chimique et la biodiversité des échantillons seront caractérisés avant et après incubation. Ces microcosmes seront spécialement conçus pour mimer des scénarios contrastés, typiques du contexte atmosphérique du site, « jour d’été » (H2O2, lumière,17°C) et « nuit d’hiver » (obscurité, pas d’H2O2, 5°C). Le comportement des communautés microbiennes sera étudié pour chaque scenario par métabolomique et transcriptomique. L’intégration de ces données « omiques » donnera une carte des réseaux métaboliques inédite. Celle-ci sera exploitée pour valider la carte du fluxome déterminée en utilisant du 13C-formaldéhyde. Les flux permettront d’accéder aux vitesses de biodégradation des composés marqués au 13C. Ces vitesses, ainsi que les voies métaboliques, seront implémentées dans un nouveau modèle de chimie atmosphérique.

Ce projet est ambitieux et innovant, à la fois pour le concept développé (« biogéochimie des nuages », l’intégration de données biologiques dans un modèle de chimie atmosphérique) et pour son aspect méthodologique (la nouveauté de l’application de la « méta-fluxomique » à un écosystème).
L’originalité de ce projet réside aussi sur le fait que l’ICCF et le LaMP sont parmi les seuls groupes au monde à étudier l’impact des microorganismes sur la chimie des nuages. Elle s’appuie aussi sur la très grande expertise du GMGM pour le métabolisme des C1 et le savoir-faire unique du LISBP pour le développement d’outils en fluxomique. La nature interdisciplinaire du projet, alliant chimie des nuages, modélisation, et étude du comportement microbien par des approches « omiques », est donc unique au plan international.

La diffusion des résultats sera basée sur des publications dans des revues à haut facteur d’impact, des communications dans des grands congrès internationaux, l’organisation d’un workshop international, une participation active à l’éducation (écoles d’été, festival « les cours d’eau H2O » dédié aux scolaires) et la création d’un logiciel libre d’accès.