CE11 - Caractérisation des structures et relations structure-fonctions des macromolécules biologiques

DE LA DYNAMIQUE ET DIVERSITÉ STRUCTURALE DES COMPLEXES MEMBRANES DU T6SS VERS LE DÉVELOPPEMENT D’INHIBITEUR DE LA VIRULENCE – T6MeD-OC

T6MeD-OC : T6ss Membrane complex Drug – Outermembrane Complex

L'OMS a récemment publié la liste des bactéries pathogènes représentant une menace pour la santé humaine. Les options thérapeutiques pour gérer cette crise deviennent rares en raison de leur multi-résistance aux antibiotiques. Une nouvelle stratégie thérapeutique a émergé récemment : cibler la virulence pour désarmer ces bactéries pathogènes et bloquer l'infection. Cette stratégie nécessite une compréhension approfondie au niveau structural et moléculaire des nanomachines de virulence.

DE LA DYNAMIQUE ET DE LA DIVERSITÉ STRUCTURALE DES COMPLEXES MEMBRANAIRES T6SS AU DÉVELOPPEMENT DES BLOQUEURS DE VIRULENCE

Les bactéries pathogènes produisent des facteurs de virulence qui sont responsables de la pathogénicité et qui favorisent la colonisation du patient. Ces déterminants de virulence sont des cibles pharmaceutiques viables. Les médicaments anti-virulence devraient réduire l'utilisation d'antibiotique et diminuer le développement de la résistance aux antibiotiques, car ils ne devraient pas imposer une forte pression sélective sur les bactéries qui favorise l'évolution des mécanismes de résistance et de persistance. De plus, comme ils n'affectent pas la viabilité des cellules bactériennes, ils ne devraient pas perturber le microbiote bénéfique. Les composés anti-virulence pourraient servir d'alternative ou de complément aux antibiotiques traditionnels. En utilisant ces molécules parallèlement au traitement antibiotique traditionnel, cela rend également les bactéries moins susceptibles de devenir résistantes au traitement médicamenteux combinatoire. <br />Le système de sécrétion de type VI (T6SS) représente une cible attractive pour développer une thérapie anti-virulence. Le T6SS est n’est pas indispensable à la vie bactérienne. Le T6SS délivre des effecteurs toxiques dans les cellules eucaryotes et procaryotes, ce qui en fait une arme redoutable capable de manipuler une grande variété de fonctions des cellules hôtes. Le T6SS est utilisé par les agents pathogènes, y compris les bactéries ESKAPE pour établir leur virulence lors de l'invasion de l'hôte humain. <br />La stratégie du «grain de sable dans les engrenages T6SS». Le T6SS est un complexe multiprotéique qui est assemblé à travers l'enveloppe bactérienne. Notre projet vise à cibler l'assemblage du complexe membranaire T6SS avec des petites molécules inhibitrices ou peptides. En agissant sur le «sabotage» de l'assemblage, ces futurs médicaments anti-T6SS seront une alternative ou un complément aux antibiotiques pour bloquer la virulence des pathogènes bactériens Gram négatifs dans le cadre de cette « crise antibiotique ».

Le projet T6MeD-OC rassemble un consortium interdisciplinaire, combinant la microbiologie clinique, fondamentale, moléculaire et structurale avec la chimie médicinale. Dans la première partie du projet, nous avons développé un pipeline intégré pour cribler des banques de molécules chimiques et de peptides qui inhibent l'assemblage de la nanomachine T6SS. Ce pipeline comprend des méthodes in vitro utilisant des protéines purifiées, des criblages in vivo directement sur différents pathogènes bactériens ainsi que des expériences dans un modèle de virulence Galleria mellonella, utilisant des souches cliniques.
Dans la deuxième partie du projet, nous utilisons la biochimie des protéines membranaires, les approches biophysiques, la microscopie cryo-électronique (cryo-EM) et la tomographie cryo-électronique (cryo-ET) pour résoudre (1) la structure haute résolution de complexe membranaire canonique du T6SS (« cT6-MC ») et (2) pour étudier le fonctionnement et la diversité structurale des complexes membranaires T6SS non canoniques («ncT6-MC») provenant d'Acinetobacter baumannii et de Bacteroides fragilis.

Première partie: En collaboration avec le groupe du Dr Xavier Morelli (CRCM, Marseille), nous avons développé un pipeline multi-échelles pour le criblage à haut et moyen débit d'inhibiteurs T6SS chez Pseudomonas aeruginosa. Ce pipeline représente un continuum d'essais in vitro à in vivo pour sélectionner et monitorer l'effet de petites molécules ou peptides anti-T6SS. Notre pipeline est basée sur le ciblage d'une interface spécifique protéine-protéine (PPI) cruciale pour l'assemblage du MC: le TssJ-TssM PPI. Notre pipeline est basé sur 3 tests qui monitorent la formation du complexe H2 TssJ-TssM (in vitro et in vivo) et 2 tests pour étudier la fonctionnalité du T6SS de P. aeruginosa (H2). Notre criblage a permis d’identifier 4 candidats qui représentent des inhibiteurs «first-in-class» ciblant le T6SS de P. aeruginosa.
En collaboration avec le groupe du Dr Riccardo Pellarin (Institut Pasteur, Paris), nous avons conçu un inhibiteur peptidique biomimétique de l'assemblage du complexe de plateforme du T6SS de la bactérie EAEC et nous avons montré son utilisation potentielle pour bloquer la virulence d'autres espèces pathogènes (manuscrit en préparation).
Deuxième partie: En collaboration avec le groupe du Dr Jean-Pierre Duneau (LISM, Marseille) et du Dr Benjamin D Ross (Dartmouth Geisel School of Medicine, États-Unis), nous avons commencé à étudier la diversité structurale du ncT6-MC. Chez le pathogène ESKAPE prioritaire de l'OMS Acinetobacter baumannii, nous avons identifié un partenaire manquant dans le complexe membranaire (abMC) et nous commençons à étudier la structure à haute résolution de l'ensemble du abMC à l'aide de la cryo-EM (manuscrit en préparation). Chez la bactérie du microbiote humain Bacteroides fragilis, nous avons pour la première fois identifié et déterminé la composition du bfMC. Des travaux sont en cours dans mon groupe et dans le groupe de BD Ross pour déterminer la structure du bfMC et reconstituer son histoire phylogénétique.

Si notre pipeline optimisé nous permet de découvrir de nouveaux inhibiteurs de T6SS et d'améliorer les molécules déjà identifiées, nous effectuerons des tests à court terme sur des modèles mammifères d'infection aiguë ou chronique. À plus long terme, ce projet améliorera le traitement des maladies infectieuses respiratoires chez les patients atteint de mucoviscidose. Ces molécules anti-virulence peuvent agir en remplacement ou en combinaison avec une antibiothérapie qui, aujourd'hui, n'est plus efficace dans la lutte contre les souches multi-résistantes de P. aeruginosa. En abordant les premières étapes qui conduisent à la colonisation des poumons des patients par P. aeruginosa, ce nouveau type de traitement qui résultera de nos recherches devrait limiter la prolifération des espèces résistantes et donc permettre un traitement efficace et durable des patients infectés.

La détermination de la structure haute résolution du ncT6-MC dans Acinetobacter baumannii et Bacteroides fragilis, démontrera pour la première fois des adaptations architecturales spécifiques de la nanomachine T6SS ainsi qu'une nouvelle histoire phylogénétique. Ces structures ouvriront la voie au développement de bloqueurs de virulence spécifiques de chaque espèce qui aideront à lutter contre les infections bactériennes résistantes aux antibiotiques.

• Manuscrit en préparation:

Cherrak Y, Filella-Merce I, Schimdt V, Sgoluppi V, Chaiaheloudjou R, Pellarin R and Durand E*.
From the structure of the TssKFG wedge complex to the identification of novel targets for anti-T6SS drug.

Cherrak Y, Kandolo O, Le Guenno H, Kosta A, Espinosa L, Roche P, Betzi S, Morelli X and Durand E*. Composition and architecture of the non-canonical T6SS membrane complex in Acinetobacter baumannii.


• Brevet en préparation:

Schimdt V, Legoff M, Roche P, Hoffer L, Betzi S, Morelli X* and Durand E* (to be define lately with the valorization cell, i.e CNRS INNOVATION). First-in-class anti-T6SS drug targeting the virulence of Pseudomonas aeruginosa.

La résistance bactérienne aux antibiotiques est une menace sérieuse pour la santé et la recherche de nouvelles molécules anti-virulences est une priorité mondiale. Cibler les facteurs de virulence, qui ne sont pas essentiels pour la vie bactérienne, devrait empêcher le développement rapide de mécanismes de résistance. Cela nécessite une compréhension moléculaire approfondie des facteurs de virulence utilisés contre l'hôte humain. Le système de sécrétion de type VI (T6SS) est un important facteur de virulence partagé par des pathogènes humains, tels que Acinetobacter baumannii, Francisella tularensis, Pseudomonas aeruginosa ou Escherichia coli entéro-aggrégatif. Le T6SS est une machine macromoléculaire composée de trois complexes architecturaux - le complexe membranaire (CM), la complexe de plateforme et la queue contractile - qui participent de manière coordonnée à l'injection de toxines dans les cellules cibles. Le CM est une partie centrale et conservée du T6SS qui est pertinente comme cible par des molécules inhibitrices. Mais, comprendre l'étendue de la diversité du CM (différences entre pathogènes et microbiote humain) en termes de structure et de composition et démontrer son architecture dynamique (transition ouvert-fermé, domaines protéiques formant le canal de membrane externe) sont autant d'étapes primordiales pour le choix rationnel des cibles des inhibiteurs. Ce projet permettra de déchiffrer la diversité structurale et la dynamique du CM appartenant à divers importants pathogènes humains et d'un représentant du microbiote humain. Nous apporterons un niveau sans précédent de détails concernant l'adaptation moléculaire du CM en fonction des bactéries pathogènes et nous comprendrons les conséquences fonctionnelles de tels changements. Nous mettrons ainsi en évidence les zones sensibles à cibler par des inhibiteurs et nous développerons des outils pour le criblage de petites molécules inhibitrices du T6SS, à la fois in vitro et in vivo, touchant différentes étapes de l'assemblage dynamique du MC. Ce projet sera pionnier dans l'identification des inhibiteurs de T6SS. Nous envisageons de répondre à ces questions en nous appuyant sur un consortium multidisciplinaire spécialisé dans la biochimie et la biologie structurale des complexes de protéines membranaires, la microbiologie moléculaire, la dynamique moléculaire, le criblage HTS de chimiothèques, la conception de médicaments et les modèles bactériens de virulence. Ce travail ouvrira la voie à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et au développement de molécules antimicrobiennes pour traiter les maladies infectieuses.

Coordinateur du projet

Monsieur Eric Durand (Laboratoire d'ingénierie des systèmes macromoléculaires)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

LISM Laboratoire d'ingénierie des systèmes macromoléculaires
CNRS DR12_UMR7258 Centre National de la Recherche Scientifique Delegation Provence et Corse_UMR7258
LISM Laboratoire d'ingénierie des systèmes macromoléculaires

Aide de l'ANR 516 039 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2018 - 42 Mois

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