Pili de type IV en action – T4PNanoAction

Nous proposons de caractériser la structure de la machinerie de piliation grâce à deux approches innovantes. La première est le pontage covalent couplé à la spectrométrie de masse. Nous proposons en particulier de développer une approche in vivo, réalisée sur des bactéries vivantes afin de cibler la machinerie dans son environnement natif. La seconde approche est la cryo-tomographie électronique. Ici, l’objectif est d’obtenir des structures à haute résolution de la machinerie, en réalisant les analyses directement à partir de la cellule entière. Ces expériences sont en cours.

Nous venons juste de mettre au point une approche de pontage covalent in vivo qui nous a d’ores été déjà permis d’obtenir des informations structurales de qualité sur un grand nombre de complexes protéiques bactériens, dont un certain nombre sont liés à la virulence. Notre approche est basée sur l’utilisation d’un agent pontant original appelé NNP9, développé en collaboration avec des chimistes bioorganiciens. Ce réactif permet de réaliser un enrichissement sélectif et très efficaces des peptides pontés obtenus par digestion enzymatique des protéines et d’éliminer tous les peptides non modifiés. Le nombre de peptides pontés obtenu pour l’analyse d’un triplicat biologique (plus de 3000) est équivalent à ce qui est obtenu traditionnellement dans la littérature par des étapes de fractionnement importantes. En ce qui concerne les expériences de microscopie électronique, une optimisation des conditions de préparation des échantillons est en cours afin d’obtenir des images de la machinerie avec la résolution la plus grande possible, sur un microscope de type Titan, installé récemment à l’Institut Pasteur.

Notre objectif pour la partie pontage covalent et de poursuivre l’optimisation de la préparation des échantillons pour obtenir plus d’informations structurales sur la machinerie de piliation, toujours dans son état natif. Différents mutants dans lesquels la machinerie est bloquée à différentes étapes de sa formation seront ensuite analysés.
Pour la partie de microscopie électronique, les images à haute résolution seront acquises dans les prochains mois.

Advanced In Vivo Cross-Linking Mass Spectrometry Platform to Characterize Proteome-Wide Protein Interactions. Martial Rey, Jonathan Dhenin, Youxin Kong, Lucienne Nouchikian, Isaac Filella, Magalie Duchateau, Mathieu Dupré, Riccardo Pellarin, Guillaume Duménil, and Julia Chamot-Rooke, Analytical Chemistry 2021.
doi.org/10.1021/acs.analchem.0c04430

Les pili de type IV (T4P) sont des structures filamenteuses présentes à la surface de nombreux pathogènes bactériens, comme Neisseria meningitidis, où ils jouent un rôle majeur dans la virulence au travers de fonctions importantes comme l’adhésion aux cellules hôtes. Une nanomachinerie moléculaire constituée de 15 protéines différentes, ancrée dans la membrane bactérienne interne et externe, assemble et désassemble constamment et rapidement ces T4P. L’objectif de ce projet est d’établir la structure de cette nanomachinerie dans les différents états associés à sa dynamique et sa maturation fonctionnelle, et donc d’accéder pour la première fois à la dynamique à haute résolution de ces structures. Cet objectif ambitieux sera réalisé en combinant des approches de pontage covalent in vivo couplé à une analyse par spectrométrie de masse (XL-MS) et de la cryo-microscopie électronique. L’utilisation combinée de ces deux techniques complémentaires est en pleine émergence. Les approches de XL-MS réalisée à l’échelle de la cellule entière apportent en effet des informations de structure sur les protéines cross-linkées et sur les réseaux d’interaction protéine-protéine qui peuvent utilisées pour affiner les modèles structuraux issus des expériences de cryo-EM. Ce projet sera divisé en quatre workpackages (WPs). Dans le WP1, des mutants spécifiques de N. meningitidis dans lesquels la machinerie est vide (pas de T4P), est en mode assemblage ou désassemblage, ou présentant des phénotypes particuliers (perte partielle ou totale de fonctions) seront préparés. Le WP2 sera consacré au développement d’un pipeline d’analyse optimisé pour réaliser des approches de XL-MS in vivo sur des cellules entières de N. meningitidis. Ce pipeline est basé sur des développements méthodologiques réalisés récemment par le coordinateur et basés sur l’utilisation d’un agent pontant trifonctionnel innovant. Le WP3 sera dédié aux analyses par cryo-EM, et plus particulièrement par cryo-tomographie electronique (cryo-ET) et au traitement d’images. Après optimisation de la préparation des échantillons, des images seront acquises sur des cellules entières de N. meningitidis (WT) et les structures seront analysées. Des mutants pour lesquels les données de XL-MS indiquent des différences majeures avec la souche sauvage seront ensuite sélectionnés pour réaliser de nouvelles images en cryo-ET. A l’issu du WP3, une carte de densité électronique sera obtenue pour la nanomachinerie des T4P de N. meningitidis (WT). Dans cette enveloppe, les régions en haute résolution pourront être attribuées directement. Pour celles ayant une résolution plus faible, les données cristallographiques déjà disponibles pour différentes protéines seront utilisées en combinaison avec les données de pontage covalent pour améliorer les modèles structuraux. L’ensemble de ces données sera agrégé grâce à l’utilisation d’outils appropriés comme IMP, Integrative Modeling Platfom (WP4). Des résultats préliminaires ont d’ores été déjà été obtenus à la fois pour les approches XL-MS in vivo sur cellules entières et en cryo-EM.
Le consortium en charge du projet regroupe trois équipes de l’Institut Pasteur ayant une expertise complémentaire en spectrométrie de masse, microbiologie et cryo-microscopie électronique. Cette expertise, combinée aux approches à l’état de l’art proposées dans le projet sont uniques. Les informations obtenues à différents niveaux (structural, fonctionnel) sur la machinerie de piliation seront primordiales pour comprendre ce système complexe, fortement impliqué dans la virulence de N. meningitidis. Elles pourront aussi permettre d’ouvrir de nouvelles pistes en terme de développement de vaccins ou traitement thérapeutiques. Par ailleurs, les méthodes développées sont aisément généralisables à d’autres pathogènes bactériens.