CE11 - Caractérisation des structures et relations structure-fonctions des macromolécules biologiques

Dynamique structurale d'un RCPG dimérique en molécule unique – DynaMuR2

Dynamique structurale d'un RCPG au niveau molécule unique

Notre projet vise à comprendre la dynamique conformationnelle d'un des récepteurs majeur pour le développement de médicaments.

Dynamique structurale d'un RCPG au niveau molécule unique.

Les objectifs de ce programme, sont de pouvoir enregister les différents changements de conformation du récepteur mGlu2. Ce récepteur est constitué de deux sous-unités, et chacune d'elle est constituée de « domaines structurés principaux: le domaine de liaison, le lien riche en cystéines, et le domaine membranaire. Nous voulons enregister les changement de conformation de chaque domaine et de voir comment ils sont coordonnés au sein du récepteur complet, afin de mieux comprendre son activation.

Les quatre méthodes qui seront utilisées sont:
1- l'analyse des signaux de FRET en population sur des récepteurs marqués à la surface de cellules transfectées par l'approche trFRET
2- le développement de plusieurs biosenseurs basés sur l'utilisation d'acides aminés non naturels (AANN), et conduisant à des variations de distances au moment des changements de conformations du récepteurs.
3- l'extraction des récepteurs marqués avec deux fluorophores (donneurs et accepteurs), afin de mesurer le signal de FRET au niveau de molécules uniques, isolées.
4- mettre en place une méthode permettant de mesurer ses variation de FRET sur molécules uniques dans un environnement cellulaire.

Au cours des 18 premiers mois nous avons:
1- valisé plusieurs biosenseurs basés sur l'utilisation d'AANN, permettant de mesurer différents changements de conformation du récepteur mGlu2 par FRET
2- utilisé le biosenseur déjà décrit pour valider notre approche en molécules uniques, et trouver les conditions permettant de conserver l'intégralité des propriétés du récepteur.
3- Grace à cette approche, nous avons montré que le Glutamate était un agoniste partiel, et que l'activité maximale du récepteur ne pouvait etre obtenue qu'en présence d'un modulateur allostérique positif, soit une petite molécule, soit la protéine G
4- Par cette approche, nous avons pu démontrer qu'un nanocorps pouvait activer le récepteur mGlu4 aussi bien que le glutamate.
5- déterminé la structure du récepteur mGlu5, GABAB, mGlu2, mGlu7 et mGlu2-7, dans différents états conformationnels.

Maintenant que nous avons mis en place les biosenseurs, et valider l'approche expérimentale, nous allons pouvoir étudier les différents changements de conformation au niveau des différents domaines du récepteur, afin de comprendre comment ces changements sont coordonnés.
Ces études seront réalisées tant sur les récepteurs homodimériques mglu2 et mGlu5, que sur des récepteurs hétérodimériques dont nous avons montré l'existence dans le cerveau

Aucun brevet n'a été déposé dans le cadre de ce programe à ce jour.
Sept publications ont par contre été publiées au cours des 18 premiers mois de ce projet, dans de grandes revues internationales:

1. Nasrallah C, Cannone G, Briot J, Rottier K, Berizzi AE, Huang C-Y, Quast RB, Hoh F, Banères J-L, Malhaire F, Berto L, Dumazer A, Font-Ingles J, Gómez-Santacana X, Catena J, Kniazeff J, Goudet C, Llebaria A, Pin J-P, Ragunath VK, Lebon G (2021) Agonists and allosteric modulators promote signalling from different metabotropic glutamate receptor 5 conformations. Cell Reports: 2021;36:109648. doi: 10.1016/j.celrep.2021.109648.
2. Cao A-M, Quast RB, Fatemi F, Rondard P, Pin J-P, Margeat E (2021) Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. bioRxiv. DOI 10.1101/2021.01.05.424557
3. Cao A-M, Quast RB, Fatemi F, Rondard P, Pin J-P, Margeat E (2021) Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nat Commun 12:5426.DOI 10.1038/s41467-021-25620-5
4. Haubrich J, Font J, Quast RB, Goupil-Lamy A, Scholler P, Nevoltris D, Acher F, Chames P, Rondard P, Prézeau L, Pin J-P (2021) A nanobody activating metabotropic glutamate receptor 4 discriminates between homo and heterodimers. Proc Natl Acad Sci (USA) 118:e2105848118.
5. Shen C, Mao C, Xu C, Jin N, Zhang H, Shen D-D, Shen Q, Wang X, Hou T, Chen Z, Rondard P, Pin J-P, Zhang Y, Liu J (2021) Structural basis of GABAB receptor-Gi protein coupling. Nature 594:594-598.
6. Du J, Wang D, Fan H, Xu C, Tai L, Lin S, Han S, Tan Q, Wang X, Xu T, Zhang H, Chu X, Yi C, Liu P, Wang X, Zhou Y, Pin J-P, Rondard P, Liu H, Liu J, Sun F, Wu B, Zhao Q (2021) Structures of human mGlu2 and mGlu7 homo- and heterodimers. Nature 594:589-593.
7. Quast R.B., Margeat E. (2021) Single molecule FRET on its way to structural biology in live cells. Nature Methods – News and Views, doi.org/10.1038/s41592-021-01084-9.

Ce projet vise à analyser la dynamique structurale d'un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) dimérique (le récepteur mGlu2) par des approches innovantes permettant l'études de molécules uniques à un niveau de résolution temporelle non encore obtenue sur ces récepteurs.
Les RCPG représentent la plus grande famille de gènes chez l’homme (3% des gènes codants). Ces récepteurs sont exprimés dans toutes les cellules et constituent un élément essentiel à la communication intercellulaire. Chaque cellule exprime plusieurs dizaines de ces récepteurs permettant une régulation fine de leur activité. Ces récepteurs sont la cible majeure des médicaments, et font l'objet de nombreux programmes de R&D industriels pour la recherche de nouvelles approches thérapeutiques, dans tous les domaines cliniques.
Des révolutions conceptuelles ont été faites ces dernières années concernant ces récepteurs, comme par exemple la capacité de certains ligands à n'activer que certaines des voies de signalisation normalement activées par un récepteur. Les données les plus récentes indiquent que cela pourrait être la conséquence d'un contrôle différentiel d'un équilibre dynamique constant entre plusieurs états conformationnels, plutôt que du passage d'un état inactif à un état actif spécifique stabilisé par un agoniste. Ces récepteurs ont aussi été décrits comme pouvant s'assembler en dimères, voire multimères constitués de récepteurs différents. Cette propriété offre de nouvelles possibilités de régulation entre ces récepteurs au travers du contrôle allostérique d'un récepteur par son partenaire. Il est donc attendu que la dynamique structurale d'une sous-unité affecte celle de son partenaire. Cependant, les dimères de RCPG sont sujets à de nombreuses controverses car leur existence et leurs rôles physiologiques restent très discutés. Ceci est due au manque d'information concernant les bases moléculaires de leur couplage allostérique et au manque d'outils permettant de les contrôler in vivo.
Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR) constituent d'excellents modèles pour l'étude de la dynamique structurale des RCPG dimériques, ces récepteurs étant des dimères constitutifs. Notre objectif est d'analyser la dynamique structurale du récepteur mGlu2 grâce à une combinaison d'approches innovantes afin de mieux comprendre les bases structurales du couplage allostérique entre protomères au sein d'un dimère. Nous analyserons la dynamique des changements conformationnels des domaines de chaque sous-unité à l'échelle de la molécule unique et dans une échelle de temps de l'ordre de la microseconde, ainsi que la dynamique des mouvements entre les sous-unités. Ces dynamiques seront analysées dans les conditions basales, inhibées par un agoniste inverse, ou au contraire activées par des ligands ortho- ou allostériques. Ainsi, des informations capitales à notre compréhension de la dynamique des RCPG et des mécanismes du couplage allostérique entre les deux sous-unités d'un dimère pourront être obtenues.
Notre projet implique 3 équipes localisées sur un même campus du site montpelliérain, celle d'E Margeat (CBS), un spécialiste de biophysique et d'analyse de la dynamique structurale par mesure de FRET en molécules uniques (smFRET), celle de G Lebon (IGF), spécialiste de la structure et de la thermostabilisation des RCPG, et enfin celle de JP Pin, reconnue internationalement dans le domaine des RCPG, et en particulier sur les récepteurs mGlu et GABAB.
Les approches innovantes basées sur la thermostabilisation des RCPG, l'analyse de la dynamique structurale à une résolution temporelle de l'ordre de la microseconde des dimères en smFRET et l'utilisation de méthodes de marquage spécifiques basées sur l'utilisation d'acides aminés non naturels, permettra de jeter les bases expérimentales à la compréhension du rôle de la communication allostérique chez les RCPG, notamment au niveau des biais de signalisation.

Coordinateur du projet

Monsieur Jean-Philippe Pin (Institut de génomique fonctionnelle)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IGF Institut de génomique fonctionnelle
CBS Centre de Biochimie Structurale
IGF Institut de Génomique Fonctionnelle

Aide de l'ANR 564 077 euros
Début et durée du projet scientifique : mars 2019 - 48 Mois

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