Ecriture en stéréo dans l'eau par un laser – SLOW2

Tâche 1: Synthèse de fluorophores (responsable Partenaire 2). Divers fluorophores excitables à 2 photons (TPE) seront synthétisés, portant deux groupes fonctionnels différents, pour permettre leur incorporation dans les branches des dendrimères. L'étude photo-physique des fluorophores TPE, en particulier leur réponse d'absorption 2P, est une tâche importante.
Tâche 2: Synthèse de dendrimères fluorescents solubles dans l’eau (responsable Partenaire 1). Les dendrimères doivent remplir trois conditions: plusieurs fluorophores TPE dans la structure (issus de la Tâche 1), la solubilité dans l'eau et les propriétés d'agrégation sous irradiation 2P. Une étude des relations structure / activité sera réalisée pour déterminer le ou les dendrimères les plus efficaces.
Tâche 3: Caractérisation du processus de stéréo-(nano)-lithographie (responsable Partenaire 1). Cette tâche est prévue pour caractériser le phénomène d’agrégation à l’aide d’outils physiques, chimiques, théoriques et biologiques disponibles dans les laboratoires des trois partenaires, sur les dendrimères synthétisés dans la Tâche 2.
Tâche 4: Comprendre le processus de stéréo-(nano)-lithographie (responsable Partenaire 3). Toutes les expériences menées dans le cadre de la Tâche 3 par les efforts conjoints des trois partenaires doivent fournir des pistes claires indiquant les causes du processus d'agrégation. De plus, des simulations de Dynamique Moléculaire permettront une représentation détaillée de la structure des dendrimères, en présence de molécules de solvant explicites, puis, l’agrégation des dendrimères sera étudiée.
Tâche 5: Marquage de cellules par stéréo-(nano)-lithographie. Structuration de tissus? (responsable Partenaire 3). La microscopie confocale à deux photons sera utilisée comme outil efficace et non invasif pour induire d'abord la nano-impression, puis pour visualiser des cellules individuelles marquées dans des cultures 2D et 3D (sphéroïdes). Des essais d'ingénierie tissulaire seront effectués.

- T1 : Quatre fluorophores originaux, présentant une forte absorption à 2 photons et émettant respectivement dans le bleu, le vert, le jaune-citron, et le rouge ont été synthétisés et caractérisés par le Partenaire 2. Une étude photo-physique compréhensive a été réalisée. Ces fluorophores ont été doublement fonctionnalisés, pour pouvoir être utilisés en tant que branches des dendrimères.
- T2 : Un dendrimère de deuxième génération, incorporant le fluorophore émetteur bleu dans les branches, et des fonctions hydro-solubilisants en surface, a été synthétisé et caractérisé par le Partenaire 1. C’est le produit avec lequel avaient été observées les propriétés de stéréo-nanolithographie, mais dont la méthode de synthèse a dû être modifiée. Il faudra incorporer dans les branches des dendrimères les autres fluorophores, varier leur localisation, et le type de fonctions terminales (en cours).
- T3 : Le dendrimère fluorescent bleu a été confié au Partenaire 2 par le Partenaire 1 pour des études photo-physiques qui sont en cours, en particulier pour une étude de l’influence de l’environnement sur l’état d’association des dendrimères. Cette étude fournira des éléments précieux permettant de mieux appréhender les conditions dans lesquelles le phénomène d’association induisant la stéréo-nanolithographie se produit.
- T4 : Le Partenaire 3 a réalisé plusieurs simulations par dynamique moléculaire (DM) sur le dendrimère fluorescent bleu dans l’eau. La première DM de 100 ns a démontré que la molécule se replie, avec le cœur d'un côté et toutes les chaines hydro-solubilisantes de l'autre. Les simulations dans de l’eau incorporant du DMF ont montré que le repliement s’effectue comme dans le cas précèdent, mais est retardé par les interactions avec les molécules de DMF, dont certains se retrouvent à l'intérieur de la structure du dendrimère. Les essais d’étude DM de l'agrégation de deux dendrimères dans l'eau ont permis de voir leur association rapide.

Les premiers essais de diversification de la structure des dendrimères fluorescents (types de fluorophores, taille du dendrimère, et types de fonctions terminales) ont été effectués mais sont largement à développer, pour produire une bibliothèque de composés permettant de faire une étude de structure/activité sur les performances d’agrégation.
Le phénomène d’agrégation des dendrimères fluorescents capables d’absorber 2 photons sous l’influence d’un laser reste encore largement à caractériser, analyser et surtout à comprendre. Lorsqu’il sera compris et prouvé, nous prévoyons d’étudier la possibilité de breveter, puis une publication dans un excellent journal scientifique généraliste, suivie d’autres publications, la présentation dans différents congrès, et une communication vers l’ANR, nos tutelles, et le grand public.
L'application du processus de nano-impression pour le marquage de cellules individuelles doit être réalisée à la fois en 2 dimensions (cultures cellulaires classiques) et en 3 dimensions (sphéroïdes). La stabilité, la toxicité et la localisation de l'impression (en surface ou à l'intérieur des cellules) doivent être étudiées. Ce processus pourrait fournir une boîte à outils pour une technologie simple, non invasive et hautement innovante pour le marquage de cellules individuelles, qui pourrait être développé par une start-up. En outre, un dérivé de cette technologie pourrait fournir une nouvelle technologie pour l’ingénierie tissulaire, même si ceci est hautement spéculatif.

Publications et présentations remerciant l’ANR:
1 publication commune à 2 Partenaires :
Fluorescent phosphorus dendrimers excited by two photons: synthesis, two-photon absorption properties and biological uses. Anne-Marie Caminade,* Artem Zibarov, Eduardo Cueto Diaz, Aurélien Hameau, Maxime Klausen, Kathleen Moineau-Chane Ching, Jean-Pierre Majoral, Jean-Baptiste Verlhac, Olivier Mongin, Mireille Blanchard-Desce. Beilstein Journal of Organic Chemistry (accepté le 04/07/2019)
1 conférence invitée commune aux 3 Partenaires :
1. Fluorescent dendrimers for biology. How Two-photon absorption properties can help? Caminade A.M.,* Majoral J.P., Hameau A., Zibarov A., Blanchard-Desce M, Verlhac J.B., Teissié J., Golzio M. International Dendrimer Symposium (IDS-11), 14/18 juillet 2019, Funchal, Madère, Portugal.
1 publication mono-Partenaire :
1. Fluorescent Phosphorus Dendrimers: Towards Material and Biological Applications. Qiu J., Hameau A., Shi X., Mignani S., Majoral J.P., Caminade A.M.*, ChemPlusChem 2019, 84, 1070-1080
1 communication orale mono-Partenaire :
1. Synthesis of fluorescent dendrimers soluble in water. A. Zibarov, A. Hameau, K. Moineau-Chane Ching, A.M. Caminade. LCC Young Investigators Seminar, LCC Toulouse, 28 juin 2019.

Nous avons découvert par hasard qu'un dendrimère (macromolécule hyper-ramifiée, à structure parfaitement définie) hydrosoluble et fluorescent par absorption de 2 photons peut induire un nouveau type de «stéréo-nano-lithographie», dans un volume d’eau, sous l'influence d'un faisceau laser. Ce procédé est très différent de la stéréolithographie classique: ce n’est pas une polymérisation, il est réversible dans le temps, se produit à faible concentration en dendrimère dans l'eau et peut être contrôlé à l'échelle de 200 nm. Il n'existe aucune technologie comparable à ce jour, et il est difficile de concevoir comment le même résultat pourrait être obtenu autrement. C'est une rupture avec tout ce qui est connu dans le domaine de l'impression 3D, quant à la nature des milieux utilisés, des processus impliqués, et de la résolution spatiale des structures imprimées. A partir de ce premier résultat inédit, il nous faut maintenant déterminer quels sont les paramètres influant sur ce phénomène, en effectuant une véritable ingénierie chimique de la structure du dendrimère, en variant le type de fluorochrome, son efficacité d’absorption à 2 photons, ses longueurs d’onde absorption et d’émission, le niveau auquel il se situe dans la structure du dendrimère, le nombre, la nature des fonctions de surface du dendrimère, et la taille/génération du dendrimère. En bref, nous allons tirer profit de la modularité chimique de la structure des dendrimères à tous les niveaux. Nous devrons également analyser et comprendre, en utilisant diverses techniques, y compris par modélisation en dynamique moléculaire (DM), les phénomènes physiques et chimiques inédits mis en jeu lors de cette stéréo-nano-lithographie dans un volume d’eau, ainsi que les conditions pour sa persistance ou son effacement dans le temps. Nos principaux objectifs seront de découvrir les raisons de ce phénomène original et d’en déterminer la portée et les limites. C'est un vrai défi fondamental.
Le phénomène que nous avons observé est plus stable à proximité d’une surface, et a été obtenu dans l’eau. Il pourrait être utilisé pour le marquage de surfaces flexibles. Nous avons obtenu la preuve de ce concept, en marquant en surface la membrane d’une cellule unique de type B16F10 (mélanome murin) parmi des dizaines d’autres, sous l’influence du laser d’un microscope bi-photon, en présence d’un dendrimère hydrosoluble et fluorescent après excitation à 2 photons. Ce marquage n’est pas dû à une interaction spécifique avec un récepteur de la membrane, et peut donc s’appliquer à tout type de cellule. Toutefois, il nous faut étudier la persistance du marquage dans le temps, dans des conditions physiologiques variées, puis vérifier si le marquage n’altère pas la viabilité et le comportement biologique fonctionnel de la cellule, et tester différents types cellulaires. Ainsi, il pourrait être utilisé pour le suivi de cellules. De plus, ces structures imprimées pourraient servir de squelette pour des architectures cellulaires en 3D (ingénierie tissulaire), en combinaison ou pas avec le greffage de ligands spécifiques à la surface du dendrimère.
Ce projet est un vrai défi fondamental, mais de plus il pourrait déboucher sur des technologies sans précédent pour le marquage et le suivi d'une seule cellule parmi des centaines, et pour la construction guidée de tissus (bio-impression). Pour relever ce défi, nous sommes 3 équipes ayant des connaissances et savoir-faire uniques et complémentaires, et internationalement reconnues chacune dans leur domaine: multiphotonique moléculaire, chimie de synthèse, dynamique moléculaire, bio-imagerie et ingénierie cellulaire. Ce projet nécessitera un partage d’informations permanent entre les trois équipes. Deux équipes sont localisées sur le même campus à Toulouse (chimiste, biologiste-biophysique et théoriciens de DM), une troisième à Bordeaux (physico-chimiste). Il est certain que cette proximité géographique permettra de nombreux et fructueux échanges.