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Publication du programme PAUSE – ANR Ukraine pour l’accueil de scientifiques ukrainiens et ukrainiennes dans des laboratoires français
DS0501 -

Facteurs cellulaires recrutés par les potyvirus pour leur transport intercellulaire : de nouvelles sources de résistance des plantes? – PotyMove

Facteurs cellulaires recrutés par les potyvirus pour leur transport intercellulaire : de nouvelles sources de résistance des plantes?

Développer des cultivars présentant des résistances génétiques vis-à-vis des phytovirus est un élément clé de l’agriculture durable. Les potyvirus provoquent de graves dommages chez les plantes cultivées. L’infection repose sur une succession d’interactions entre protéines virales et protéines de l’hôte. L’absence ou la mutation d’un facteur essentiel au virus entraîne la résistance de la plante. Connaître les mécanismes de ces interactions permet d’identifier de nouvelles sources de résistance.

Identifier les protéines membranaires et de plasmodesmes recrutées par les protéines virales pour le transport intercellulaire des potyvirus, qui seront à l’origine de nouvelles sources de résistance

Le développement de variétés présentant des résistances génétiques vis-à-vis des phytovirus est un des éléments clés de la compétitivité des producteurs et de l’agriculture durable. Cependant, l’utilisation de ces gènes de résistance reste limitée par leur disponibilité et l’émergence de populations virales capables de s’adapter à ces gènes de résistance. Ces dernières années, un résultat majeur a été l’identification par les partenaires du projet PotyMove du facteur d’initiation de la traduction eIF4E en tant qu’élément clé de l’interaction plante-virus et de la résistance des plantes, en particulier vis-à-vis du grand groupe des Potyvirus. Les partenaires du projet PotyMove ont été parmi les pionniers en démontrant le concept de « perte de sensibilité » dont la généricité pour la résistance des plantes aux virus a été clairement démontrée pour eIF4E. <br />Il est cependant nécessaire de caractériser de nouvelles cibles de résistance afin de mettre en place des résistances à plus large spectre, mais également à forte durabilité. Pour cela, le projet PotyMove propose de chercher des cibles originales de résistance aux potyvirus selon un angle nouveau, en ciblant spécifiquement l’étape cruciale de mouvement du virus de cellule à cellule. Identifier les gènes et les protéines de la plante hôte impliqués dans ce mouvement doit permettre de mettre en place des résistances génétiques bloquant ou réduisant ce mouvement au niveau local, ce qui au niveau de la plante entière se traduira par une réduction de l’accumulation virale, mais aussi une réduction du risque d’apparition et de propagation de souches virales contournant des résistances de type eIF4E.

Par souci d’efficacité et de cohérence, le projet sera principalement centré sur l’étude du pathosystème modèle Arabidopsis thaliana/Turnip mosaic virus (TuMV). Lors du mouvement de cellule à cellule, les virus exploitent les plasmodesmes (PD), en produisant des protéines permettant le passage du génome viral, nommées protéines de mouvement (MP). En utilisant comme appâts ces protéines virales pour piéger des partenaires grâce à une approche originale de protéomique des plasmodesmes mise en place par un de nos partenaires, nous caractériserons les protéines de plasmodesmes et/ou membranaires de la plante hôte que le virus utilise pour son mouvement intercellulaire. En parallèle, deux approches génétiques complémentaires, basées sur l’étude chez Arabidopsis de la variabilité naturelle et sur une population mutagenisée, respectivement, seront menées pour caractériser les gènes de la plante impliqués dans ces mêmes mécanismes. Le rôle des différents candidats identifiés dans des mécanismes de résistance au mouvement des potyvirus sera évolué à l’aide de méthode d’analyses de résistances quantitatives fines que nous mettrons en place. Aussi, afin d’assurer le haut potentiel de transférabilité des gènes candidats identifiés, nous étudierons le spectre d’action de résistance associé à ces gènes, ainsi que leur capacité à renforcer la durabilité de résistance médiée par les facteurs eIF4E. Enfin, nous mènerons une approche globale de validation dans une plante d’intérêt agronomique, la tomate.

Le rôle dans le mouvement viral, des protéines candidates disponibles au début du projet (PreP et REM) est en cours de validation, via un phénotypage fin de l’infection virale des mutants KO d’Arabidopsis correspondants. En utilisant comme appâts chacune des protéines de mouvement virales (MP), 68 partenaires membranaires et ou de plasmodesmes (PD) ont été identifiés lors d’un criblage d’une banque d’ADNc d’Arabidopsis par Split Ubiquitin Yeast Two Hybrid. Grace aux données disponibles du protéome de PD d’Arabidopsis, 12 candidats ont été sélectionnés pour les expériences de validation fonctionnelle.
Deux types d’analyses génétiques ont été menés pour identifier par criblage génétique, des facteurs de plantes impliqués potentiellement dans le mouvement des potyvirus : i) le criblage en conditions naturelles d’une collection de 397 génotypes d’Arabidopsis a fait l’objet d’un génotypage pour leur réponse à l’infection par le TuMV. La charge virale des échantillons infectés et les pourcentages d’infection ont été calculés, et l’ensemble de ces données ont été utilisées comme traits phénotypiques dans des analyses de cartographie de type Genome Wide Association (GWA). Ces analyses ont mis en particulier en évidence une région du génome du chromosome 1 (couvrant environ 60 gènes), impliquée dans la réponse au TuMV. ii) Un criblage à haut débit portant sur une population d’Arabidopsis KO-eIFiso4E mutagénéisée par l’agent chimique EMS, a été réalisé grâce à l’agro-inoculation en masse d’un isolat de TuMV-GFP contournant la résistance-eIFiso4E. L’utilisation du système d’imagerie fluorométrique par FluorCam a permis de suivre la cinétique de propagation du TuMV-GFP contournant et de détecter une dizaine de familles mutées indépendantes, chez qui une résistance au virus TuMV-GFP contournant a été générée: la cartographie des populations F2 est en cours pour 5 de ces familles.

Les trois protéines de mouvement (MP), ainsi qu’un contrôle négatif (GFP) et positif (protéine de mouvement 2B du GFLV connue pour recruter PDLP1, un marqueur des PD) ont été surexprimés avec succès chez Escherichia coli sous forme de protéines de fusion GST. Des fractions enrichies en PD ont été purifiées à partir de suspensions cellulaires d’Arabidopsis. Dans ces fractions PD, des interacteurs des protéines GST-MP seront recherchés par pull-Down. En parallèle, des lignées cellulaires d’Arabidopsis exprimant de façon inductible chacune des MP ainsi qu’un replicon viral (TuMV-GFP) seront construites. Ces lignées permettront de mener une analyse de protéomique comparative à partir de fractions enrichies en PD purifiées à partir de cellules saines et infectées par le TuMV.
Pour la validation fonctionnelle des candidats, nous poursuivrons un phénotypage à différentes échelles: i) celle de la plante entière (FluorCam) pour suivre la cinétique de propagation d’un virus étiqueté GFP ii) pour les candidats les plus prometteurs, un niveau de phénotypage plus fin sera réalisé en microscopie confocale grâce à une construction virale agroinfiltrable porteuse d’une double cassette de gènes rapporteurs permettant de distinguer les cellules où il y a eu infection primaire de celles qui ont été envahies après mouvement de cellule à cellule du virus. Pour compléter ce phénotypage et nous mènerons des analyses d’accumulation virale dans des protoplastes d’Arabidopsis après infection virale.
Enfin, afin d’assurer le haut potentiel de transférabilité des gènes candidats identifiés, nous étudierons le spectre d’action de résistance associé à ces gènes, ainsi que leur capacité à renforcer la durabilité de résistance conférée par les facteurs eIF4E (pyramidage). A plus long terme, nous mènerons une approche globale de validation dans une plante d’intérêt agronomique, la tomate, en utilisant la stratégie CRISPR-Cas-9.

A. Bastet, B. Lederer, N. Giovinazzo, X. Arnoux, S. German-Retana, C. Reinbold, V. Brault, D. Garcia, S. Djennane, S. Gersch, O. Lemaire, C. Robaglia and J.L. Gallois. (2018). Trans-species synthetic gene design allows resistance pyramiding and broad spectrum engineering of virus resistance in plants. Plant Biotechnology Journal. pp. 1–13. doi: 10.1111/pbi.12896.

Le développement de variétés présentant des résistances génétiques vis-à-vis des phytovirus est un des éléments clés de la compétitivité des producteurs et de l’agriculture durable. Cependant, l’utilisation de ces gènes de résistance reste limitée par leur disponibilité et l’émergence de populations virales capables de s’adapter à ces gènes de résistance. Ces dernières années, un résultat majeur a été l’identification par les partenaires du projet PotyMove du facteur d’initiation de la traduction eIF4E en tant qu’élément clé de l’interaction plante-virus et de la résistance des plantes, en particulier vis-à-vis du grand groupe des Potyvirus. Les partenaires du projet PotyMove ont été parmi les pionniers en démontrant le concept de « perte de sensibilité » dont la généricité pour la résistance des plantes aux virus a été clairement démontrée pour eIF4E.
Il est cependant nécessaire de caractériser de nouvelles cibles de résistance afin de mettre en place des résistances à plus large spectre, mais également à forte durabilité. Pour cela, le projet PotyMove propose de chercher des cibles originales de résistance aux potyvirus selon un angle nouveau, en ciblant spécifiquement l’étape cruciale de mouvement du virus de cellule à cellule. Identifier les gènes et les protéines de la plante hôte impliqués dans ce mouvement doit permettre de mettre en place des résistances génétiques bloquant ou réduisant ce mouvement au niveau local, ce qui au niveau de la plante entière se traduira par une réduction de l’accumulation virale, mais aussi une réduction du risque d’apparition et de propagation de souches virales contournant des résistances de type eIF4E.
En rassemblant un consortium à forte complémentarité, mais également grâce à la collaboration avec deux équipes étrangères, PotyMove propose un plan de travail qui permettra de caractériser ces nouvelles cibles mais également de valider leur potentiel de transférabilité à des espèces d’intérêt agronomique. Par souci d’efficacité et de cohérence, le projet sera principalement centré sur l’étude du pathosystème modèle Arabidopsis thaliana/Turnip mosaic virus (TuMV). Lors du mouvement de cellule à cellule, les virus exploitent les plasmodesmes (PD), en produisant des protéines permettant le passage du génome viral, nommées protéines de mouvement (MP). En utilisant comme appâts ces protéines virales pour piéger des partenaires grâce à une approche originale de protéomique des plasmodesmes mise en place par un de nos partenaires, nous caractériserons les protéines de plasmodesmes et/ou membranaires de la plante hôte que le virus utilise pour son mouvement intercellulaire. En parallèle, deux approches génétiques complémentaires, basées sur l’étude chez Arabidopsis de la variabilité naturelle et sur une population mutagenisée, respectivement, seront menées pour caractériser les gènes de la plante impliqués dans ces mêmes mécanismes. Le rôle des différents candidats identifiés dans des mécanismes de résistance au mouvement des potyvirus sera évolué à l’aide de méthode d’analyses de résistances quantitatives fines que nous mettrons en place. Aussi, afin d’assurer le haut potentiel de transférabilité des gènes candidats identifiés, nous étudierons le spectre d’action de résistance associé à ces gènes, ainsi que leur capacité à renforcer la durabilité de résistance médiée par les facteurs eIF4E. Enfin, nous mènerons une approche globale de validation dans une plante d’intérêt agronomique, la tomate.
En réunissant des expertises complémentaires, notre projet vise en l’espace de quatre ans à définir chez la plante une nouvelle classe de facteurs de résistance par perte de sensibilité. Cela devrait mettre à la disposition des sélectionneurs, des résistances génétiques complétant et renforçant les résistances déjà disponibles liées aux facteurs d’initiation de la traduction, pour permettre de lutter efficacement contre les potyvirus sans avoir recours aux pesticides.

Coordinateur du projet

Madame Sylvie GERMAN-RETANA (UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

INRA-UR 1052 Génétique et Amélioration des Fruits et Légumes (GAFL)
LBM Laboratoire de Biogénèse membranaire
INRA- UMR BFP 1332 UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie

Aide de l'ANR 576 579 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2016 - 48 Mois

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