Comprendre l'assemblage des complexes macro-moléculaires en utilisant les snoRNP C/D comme modèle – snoRNPASSEMBLY

En utilisant à la fois le système humain et le système de levure, nous suivrons cinq axes: (i) des approches protéomiques pour caractériser le processus d’assemblage in vivo et pour identifier de petits éléments constitutifs de la réaction d’assemblage; (ii) des études d'interactions systématiques pour cartographier les sites d'interaction protéine-protéine et protéine-ARN au niveau d'acides aminés et de nucléotides simples; (iii) des études structurales de sous-complexes clés (RMN, rayons X, spectrométrie de masse structurale, cryo-EM) et utilisation de stratégies intégratives pour des intermédiaires d'assemblage plus importants; (iv) mise au point d'un système d'assemblage in vitro se prêtant à des expériences biochimiques / biophysiques; (v) expériences fonctionnelles in vivo ou in vitro.

*Notre consortium a découvert l'existence d'un nouveau co-chaperon de type R2TP, appelé R2SP (Maurizy et al., Nat Commun 2018). Il comprend les protéines RUVBL1 / 2, PIH1D2 (homologue de PIH1D1) et SPAG1 (homologue de RPAP3). Le R2SP fonctionne également dans le repliement quaternaire, comme R2TP.

*Nous avons effectué une analyse structurale détaillée des domaines de RPAP3, seuls et en complexe avec des fragments de HSP70, HSP90 et PIH1D1. Ceci a été publié dans Henri et al., Structure 2018.

*Notre consortium a découvert l'existence d'un nouveau co-chaperon de type R2TP, appelé R2SP. Il comprend les protéines RUVBL1 / 2, PIH1D2 (homologue de PIH1D1) et SPAG1 (homologue de RPAP3). Le R2SP fonctionne également dans le repliement quaternaire, comme R2TP.

*Nous avons effectué une analyse structurale détaillée des domaines de RPAP3, seuls et en complexe avec des fragments de HSP70, HSP90 et PIH1D1.

1-Henri J., Chagot M-E., Bourguet M., Abel Y., Terral G., Maurizy C., Aigueperse C., Georgescauld F., Vandermoere F., Saint-Fort R., Behm-Ansmant I., Charpentier B., Pradet-Balade B., Verheggen C., Bertand E., Meyer P., Cianférani S., Manival X., Quinternet M. Deep structural analysis of RPAP3 and PIH1D1, two components of the HPS90 co-chaperone R2TP complex, Structure, 2018, 26, 1196-1209.

2-Maurizy C., Quinternet M., Abel Y., Verheggen C.,. Santo P E, Bourguet M., Paiva A.C.F., Bragantini B., Chagot M-E., Robert M-C., Abeza C., Fabre P., Fort P., Vandermoere F, Sousa P.M. F., Rain J-C., Charpentier B., Bandeiras T-M., Cianférani S., Pradet-Balade B., Manival X., Bertrand E. The RPAP3-Cterminal domain identifies R2TP-like quaternary chaperones. Nature Communications, 2018, 9, 2093

De nombreuses fonctions cellulaires sont accomplies par des machines moléculaires faites de complexes RNA-protéine comme le ribosome et le spliceosome. Pour la cellule, il est essentiel de produire ces particules RNP dans un état fonctionnel, et ceci peut être très complexe. Des études réalisées dans de nombreux systèmes ont montré que l'assemblage des particules RNP requiert un grand nombre de facteurs dédiés. Ces facteurs chaperonent les sous-unités libres, augmentent la spécificité de l'assemblage, transportent les sous-unités et contrôlent la qualité des particules produites.

Devant l'importance des machineries d'assemblage des particules RNP, il n'est pas surprenant qu'il existe aussi des machineries qui assemblent les complexes composés uniquement de protéines. Des études récentes montrent que les facteurs d'assemblage sont liés aux machineries catalysant le repliement des protéines. En effet, l'obtention d'une structure quaternaire peut être vue comme une extension du repliement tertiaire, à la différence que la réaction a lieu en trans et non en cis. Ceci introduit cependant des difficultés particulières liées à la stoichiométrie et à la concentration des sous-unités libres. Comme de nombreuses machines cellulaires sont composées d'assemblages macro-moléculaires stables, il est important de comprendre comment la cellule les construit.

HSP90 est une chaperone très conservée impliquée dans les étapes tardives du repliement des protéines. Elle forme un pince dimérique dont la conformation est régulée par la liaison et l'hydrolyse de l'ATP, et des co-chaperones contrôlent son cycle ATPasique. Le RT2P est une chaperone décourverte récemment et qui est impliquée dans l'assemblage de complexes macro-moléculaires. Il a été montré qu'elle est impliquée dans l'assemblage des ARN polymérase, des snoRNP, des snRNP, de la télomérase, et des complexes contenant des kinases de la famille des PIKK.

Notre but est de découvrir le mécanisme d'action du système HSP90/R2TP en utilisant les snoRNP C/D comme modèle. Nous voulons apporter des idées innovantes et applicables à d'autres machineries d'assemblage.

Nos résultats précédents suggèrent un mécanisme à trois étapes pour l'assemblage des snoRNP C/D: (i) une cliente serait chargée sur HSP90 et stabilisée par celle-ci; (ii) une deuxième client serait chargée sur la chaperone par le R2TP, et la chaperone induirait l'association des deux clientes; (iii) le R2TP transfèrerait les clientes assemblées aux AAA+ ATPases RUVBL1/2. Le complexe ainsi formé serait stable et pourrait participer aux étapes d'assemblage ultérieures. A la fin du processus, les RUVBL1/2 seraient relarguées et recyclées sur le R2TP. Ce modèle résoud le problème des intermédiaires d'assemblage instables. Il propose un rôle direct de la chaperone dans l'assemblage et clarifie également le rôle moléculaire des RUVBL1/2, qui jusque là était élusif.

A l'aide des systèmes humain et levure, nous suivrons cinq axes: (i) des approches de protéomique pour caractériser les briques élémentaires de la réaction d'assemblage; (ii) des études d'interaction systématiques pour déterminer les sites d'interaction protéine-protéine et protéine-ARN; (iii) des études structurales des sous-complexes clés (RMN, rayons X, masse-spectrométrie structurale, cryo-EM); (iv) le développement d'un essai d'assemblage in vitro utilisable pour des études biochimiques et biophysiques; (v) des expériences fonctionelles in vivo et in vitro.

Notre consortium a l'expertise nécessaire et aussi de nombreux résultats préliminaires qui augmentent les chances de succès. Etant donné la variété des substrats du R2TP ainsi que l'implication des RUVBL1/2 dans de nombreux processus cellulaires, ce projet aura un impact direct dans de nombreux domaines. De plus, il permettra de mieux comprendre comment les proteines acquièrent leur structure quaternaire, un processus de base qui est toujours mal connu.