Amyloïdes fonctionnels formés par les hydrophobines du pathogène fongique Aspergillus fumigatus – FUNHYDRO

L’assemblage in vitro des hydrophobines est étudié (i) par RMN en solution pour déterminer la structure du monomère qui s’auto associe en fibres amyloïdes, (ii) par infrarouge à transformée de Fourier afin d’établir les changements de structure secondaire et (iii) en suivant l’effet de mutations ponctuelles sur les cinétiques d’assemblage à l’aide de marqueurs fluorescents de fibres amyloïdes (Thioflavine T) afin d’identifier les résidus au cœur du squelette des fibres. L’influence des CPCs sur la fibrillation des hydrophobines est caractérisée en étudiant leur effet sur les cinétiques d’assemblage. La morphologie des fibres in vitro et à la surface des spores sont analysées par microscopie à force atomique.
La structure de la forme amyloïde des hydrophobines est étudiée par RMN du solide. Les éléments de structure secondaire seront comparés entre les formes assemblées et monomériques afin d’élucider les changements de conformation nécessaires à la formation de fibres. A partir de la RMN du solide, nous obtiendrons des contraintes de distance (i) afin de déterminer la structure tridimensionnelle des sous-unités d’hydrophobines dans le contexte des fibres et (ii) pour établir l’architecture supramoléculaire des bâtonnets.
La structure 3D des bâtonnets sera calculée à l’aide du logiciel ARIA en utilisant des méthodes inspirées de la RMN du liquide ainsi qu’avec une nouvelle approche probabilistique qui sera développée pour estimer l’incertitude des modèles calculés.
Les interactions entre hydrophobines et entre celles-ci et les CPCs sont caractérisées en analysant des mutants de délétion simples et multiples d’hydrophobines et/ou de CPCs. Les interactions seront aussi étudiées par RMN du solide avec une résolution site-spécifique en utilisant des CPCs purifiés et les bâtonnets d’hydrophobines.

Nous avons montré que les hydrophobines RodA, RodB et RodC, présentes dans la paroi cellulaire des spores, forment des fibres amyloïdes bona fide et que leur fibrillation nécessite d’une interface eau/air. La formation d’amyloïdes est accompagnée d’une perte de structures désordonnées et d’un gain de feuillets ß intermoléculaires. L’analyse de transitions thermiques et de l’auto-assemblage au contact de différents types de surface a indiqué que ces protéines interagissent avec les surfaces, montrent une plasticité conformationnelle importante et que la surface d’auto-assemblage influence les assemblages qu’elles forment.
Les interactions entre hydrophobines et entre hydrophobines et les composants majeurs de la paroi cellulaire ont été analysées à l’aide de mutants d’A. fumigatus. La caractérisation de mutants simples et multiples d’hydrophobines et/ou de CPCs a mis en relief que RodA est la seule hydrophobine requise pour former la couche de bâtonnets qui recouvre les spores, pour rendre les spores hydrophobes, pour fournir de la résistance au stress physique ou chimique et pour l’inertie immunitaire. Nous avons montré qu’aucune hydrophobine n’interagit avec RodA pour modifier la couche de bâtonnets qui recouvre les spores. L’analyse de mutants de délétion simples, doubles et triples de RodA, de mélanine et de a1,3-glucane a indiqué que les trois polymères sont nécessaires pour former une paroi cellulaire totalement fonctionnelle, rigide, hydrophobe et imperméable.
Nous avons établi un protocole standard pour calculer des structures pentamériques de fibres amyloïdes à partir de données de RMN du solide et nous les avons valider avec des amyloïdes fonctionnels étudiés par un membre du consortium (A. Loquet). De plus, nous avons avancé dans l’incorporation de nouveaux termes d’énergie dans le logiciel ARIA pour aider au calcul de structures fibrillaires à partir de données de RMN.

Nous nous sommes centrés sur l’étude du mécanisme de fibrillation, sur les interactions des hydrophobines et sur le développement de méthodes pour calculer des structures d ‘assemblages fibrillaires symétriques. Notre travail portera maintenant davantage sur la caractérisation des bâtonnets d’hydrophobines par RMN du solide, sur leurs interactions in vitro avec les composants majeurs de la paroi cellulaire et sur l’effet des CPCs sur l’assemblage des hydrophobines.

1. Pham CLL#, de Francisco BR#, Valsecchi I, Dazzoni R, Pillé A, Lo V, Ball SR, Cappai R, Wien F, Kwan AH, Guijarro JI*, Sunde M* (2018). Probing Structural Changes during Self-Assembly of Surface-Active Hydrophobin Proteins that Form Functional Amyloids in Fungi. J Mol Biol, doi: 10.1016/j.jmb.2018.07.025.
#First co-author; * Corresponding author
2. Valsecchi I, Dupres V, Stephen-Victor E, Guijarro JI, Gibbons J, Beau R, Bayry J, Coppee J-Y, Lafont F, Latge J-P, Beauvais A. (2018). Role of Hydrophobins in Aspergillus fumigatus. J of fungi. (1). doi: 10.3390/jof4010002.
3. Valsecchi I, Dupres V., Michel J-P, Duchateau M, Matondo M, Chamilos G, Saveanu C, Guijarro JI, Aimanianda V., Lafont F., Latge J-P, Beauvais A. (2018 - accepted). The puzzling construction of the conidial outer layer of Aspergillus fumigatus. Cellular Microbiology.