Caractérisation des topologies de G-quadruplexes in vivo et identification des protéines partenaires – G4-TopIPro

Nous avons mis au point un système biomoléculaire basé sur l'utilisation d'un gabarit peptidique sur lequel sont accrochés les séquences oligonucléotidiques formant le G4. Cette stratégie permet de contraindre le G4 en une topologie unique et prédéterminée supprimant ainsi le polymorphisme inhérent aux G4.
Ces systèmes sont ensuite accrochés via une biotine ancrée sur le gabarit peptidique sur des billes magnétiques fonctionnalisées par de la streptavidine permettant l'utilisation de la technique de «fishing« pour capturer des protéines d'un extrait cellulaire. Celles-ci sont ensuite identifiées par analyse protéomique. Des contrôles sont également utilisés pour sélectionner des protéines sélectives du G4 et d'un composant du G4 (boucle par exemple). La preuve de concept de cette stratégie a auparavant été réalisée en utilisant des protéines connues pour interagir avec l'ADN G4 et visualisées sur gel par la technique de «western blot«.

La synthèse d'édifices biomoléculaires plus sophistiqués à topologie unique a pu être réalisée en utilisant des ligations chimiosélectives successives et qui ont montré leur compatibilité.
L'utilisation de la technique de capture de protéines sur les billes, suivie de l'analyse protéomique a permis de mettre en évidence une certaine sélectivité des diverses protéines pour le G4 en topologie parallèle versus le G4 en topologie antiparallèle. En outre, nous avons identifié des nouveaux complexes protéiques interagissant avec les G4, dont le complexe NELF (Negative Elongation Factor) qui contrôle le «pausing« de l’ARN Polymérase II au cours de la transcription.

Les différentes ligations mises au point vont être exploitées pour l'élaboration d'autres systèmes d'ADN tétramériques notamment des ADN G4 portant des boucles internes.
Les différents systèmes mis au point sont utilisés pour étudier aussi l'interaction avec des petites molécules. Dans ce contexte, nous collaborons d'une part avec l'Institut Curie d'Orsay (équipe M.-P. TEULADE-FICHOU) pour étudier des ligands de G4 développés dans son équipe. D'autre part, nous avons pu initier grâce à ces systèmes G4 contraints une collaboration à l'international avec le groupe de B. ELIAS à l'université de Louvain la Neuve. Dans ce cadre, nous étudions l'interaction de G4 avec des complexes métalliques photo-activables du ruthénium et d'iridium. Nous avons ainsi pu mettre en évidence une bonne affinité de certains complexes avec l'ADN G4. Ces molécules ont également montré une bonne photo-cytotoxicité et sont actuellement exploités pour des études sur petit animal.
Une autre perspective intéressante exploitant ces résultats au niveau de la chimie concernent la conception d'ADN tétramoléculaire de type i-motif. En effet, nous avons démontré que grâce à la contrainte exercée par le gabarit cyclo-décapeptide nous pouvons stabiliser ce motif particulier à pH physiologique. Ce système pourra ainsi être exploité pour la recherche de ligands sélectifs de i-motif mais également pour identifier des protéines interagissant avec cet ADN i-motif: le point extrêmement novateur étant que ces études pourront être réalisées à pH physiologique.
Au niveau biologique, outre l’identification de facteurs connus pour interagir directement ou être associés à la biologie des G4, nous avons aussi identifié des nouveaux complexes pour lesquels leur impact cellulaire à travers leur action sur les G4 reste à étudier. A l’heure actuelle, nous sommes en train d’invalider au niveau cellulaire un certain nombre de ces facteurs via des approches CRISPR/Cas9.

Une première publication en synthèse (Chem. Eur. J. 2017, 23, 5602) décrit l'utilisation de trois ligations chimiques consécutives permettant ainsi l'élaboration d'un système G4 issu du génome de HIV.
Une seconde publication (Org. Biomol. Chem., 2020, 18, 6394) décrit l'utilisation de quatre ligations successives pour synthétiser un ADN tétramérique. Ceci a fait l'objet de la thèse d'Alexandre Devaux soutenu le 1er juillet 2020 auprès de l'université Grenoble Alpes.
Une autre publication (en correction pour Scientific Report) décrit l'utilisation des systèmes contraints pour la capture de protéines, cette publication a été déposée sur le site BioRxiv (https://doi.org/10.1101/2021.04.06.438633). Enfin, la thèse d’Angélique Pipier qui porte sur ce projet a été soutenue le 15 octobre 2020 auprès de l’université Toulouse 3.

La structure en double hélice de l'ADN est formée par l'association de deux brins en antiparallèle via des liaisons hydrogènes de type Watson-Crick entre les paires de bases canoniques A/T et G/C. Cependant, il existe d'autres structures plus élaborées d'acides nucléiques dont l'existence et la pertinence biologique ont été démontrées. Parmi celles-ci, on trouve des structures tétramériques telles que les G-quadruplexes et les i-motifs. Ainsi, les acides nucléiques riche en guanines sont capables de former en solution des structures tétramériques dues à l'association, via des liaisons hydrogènes de type Hoogsteen, de tétrades de guanines et leur empilement. Ces motifs G-quadruplex possèdent également des bases non-appariées reliant les différentes guanines des tétrades et forment ainsi des boucles.
Des techniques de séquençage et de bioinformatique du génome humain indiquent que celui-ci contient plus de 700000 séquences ayant le potentiel de former des structures G-quadruplex stables. Celles-ci sont situées notamment à l'extrémité des chromosomes au niveau des séquences télomériques, où elles sont impliquées dans la régulation de la télomérase, une enzyme transcriptase inverse qui est suractivée dans 80% des tumeurs cancéreuses. On les retrouve également dans les régions promotrices d'un certain nombre de gènes comme les proto-oncogènes c-myc, c-KIT et KRAS. Les ARN G-quadruplexes semblent également jouer un rôle biologique et seraient impliqués dans des processus biologiques tels que la régulation de la traduction, le traitement pré-ARN messager, la régulation des télomères. Plus récemment, l'association d'ADN et d'ARN pour former des structures quadruplexes hybrides a suscité un intérêt croissant car ces structures ADN/ARN joueraient un rôle dans la régulation de la transcription. Ces G-quadruplexes seraient impliquées dans certaines pathologies ou maladies chroniques liées à un dysfonctionnement cellulaire. La formation de G-quadruplex a aussi été associée à l'existence de troubles génétiques, aux maladies dégénératives liées à l'âge, aux cancers et aux infections par les virus. Toutes ces études mettent en exergue le rôle biologique important des G-quadruplexes qui sont désormais considérés comme une cible d'intérêt pour la conception de médicaments.
Une caractéristique majeure des G-quadruplexes est leur nature polymorphique. En effet, en fonction de la concentration du milieu notamment en cations, de la longueur et de la séquence, ils peuvent adopter différentes conformations dans lesquelles les brins sont parallèles ou antiparallèles, avec la présence de différents types de boucles (latérale, en diagonale ou en interne) et de longueur variable. Ce polymorphisme structural représente un sérieux inconvénient pour les études de reconnaissance du G-quadruplex par des composants biologiques et limite ainsi les études de structure-activité avec les protéines interagissant avec ceux-ci. En outre, les études structurales réalisées principalement in vitro ne peuvent pas être entièrement transposées dans le milieu intracellulaire complexe et ainsi les topologies adoptées par le G-quadruplex in vivo restent largement inconnues.
Dans ce contexte, les objectifs de ce projet sont :
i) la conception et la synthèse d'un panel de différentes topologies de G-quadruplex montrant une pertinence biologique à l'aide d'une stratégie permettant de contraindre cette topologie.
ii) l'utilisation de ces systèmes contraints pour l'identification et la caractérisation de protéines interagissant avec une topologie bien définie de G-quadruplex. Cela permettrait de fournir une base de données utile à la communauté scientifique pour mieux comprendre la façon dont les protéines cellulaires interagissent avec, modulent et sont modulées par ces structures.
iii) la production d'anticorps spécifiques pour une topologie G-quadruplex donnée afin de répondre à la question de la nature de la topologie du G-quadruplex in vivo.