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Nouvelle stratégie d'étude structurale des petites molécules en interaction avec des complexes supramoléculaires – SMOL

Etude structurelle de petites molécules en interaction avec des complexes supramoléculaires

La maladie d’Alzheimer résulte d’un processus pathologique qui conduit à la formation des dégénérescences neurofibrillaires et des plaques ß-amyloïdes. Ces protéines constituées de chaînes peptidiques s’auto-assemblent pour former des structures multimériques. A ce jour, l’incompréhension sur les mécanismes de formation de ces lésions persiste car il demeure difficile d’accéder à la structure atomique et à l’organisation, aussi bien moléculaire que supramoléculaire des nano-objets formés.

Détermination de la structure atomique de Phe-Phe au sein d’un auto-assemblage nano-tubulaire

Le dipeptide diphénylalanine (Phe-Phe), comme molécule modèle, est une petite molécule qui a suscité notre attention. Il est bien connu pour son aptitude à s’auto-assembler. Selon le solvant utilisé, il peut soit former des cristaux, soit former des nanotubes monodisperses. La séquence Phe-Phe est retrouvée dans une large variété de peptides en particulier dans les peptides amyloïdes et anti-amyloïdes où ils sont suspectés de jouer un rôle crucial. En plus de leurs propriétés biologiques intéressantes, les nanotubes de Phe-Phe pourraient servir au développement de nouveaux matériaux, de biogels et de médicaments porteurs à base de nanotubes/vésicules. Cependant, malgré d’intenses efforts de recherche pour caractériser et déterminer la conformation des nanotubes de Phe-Phe, le mystère plane toujours sur la structure à l’échelle atomique de cette molécule au sein d’un système complexe organisé. En effet, les techniques classiques comme la diffractométrie par rayon X et la RMN, aussi bien à l’état solide que liquide, n’apportent que des informations partielles nécessaires à la construction de la structure 2D ou 3D de la molécule. Cependant, si la conformation de Phe-Phe au sein des cristaux a été résolue par diffractométrie aux rayons X, sa conformation au sein des nanotubes reste inconnue. L’objectif général du projet est donc de développer une nouvelle stratégie visant à déterminer la conformation d’une petite molécule, en l’occurrence Phe-Phe, au sein d’un assemblage de nanotubes. Cette stratégie aurait un effet bénéfique pour la société en ce sens qu’elle contribuera à maitriser les processus biologiques fondamentaux impliqués dans les maladies dégénératives. Et par la suite, cela permettra d’apporter une solution thérapeutique par l’industrie pharmaceutique.

La démarche utilisée dans le projet repose sur l’utilisation de la RMN du tritium (3H) à l’état solide qui permet d’accéder à des distances interatomiques supérieures à 10 Å du fait que le rapport gyromagnétique de cet isotope est le plus élevé. De cette manière, les mesures peuvent être directement réalisées sur les auto-assemblages. La stratégie proposée, appliquée dans le projet SMOL, combine trois grandes techniques à savoir : la modélisation moléculaire qui permet de définir les positions bien spécifiques à marquer avec un atome de tritium ; la synthèse organique suivie du marquage au tritium régio-, chimio- et stéréospécifique des précurseurs précédemment définis ; et enfin la RMN à l’état solide du tritium pour mesurer les distances intra- et interatomiques entre les différents atomes de tritium qui serviront à la reconstruction de la structure moléculaire et la comparaison à la structure cristalline de référence déjà connue.

À l’aide de la modélisation moléculaire, trois molécules de Phe-Phe ditritiés ont été définies pour la mesure de distances intramoléculaires. Deux d’entre elles ont été synthétisées et marquées au tritium sur les cycles aromatiques de chacune des phénylalanines (le but étant de positionner les cycles aromatiques l’un par rapport à l’autre). La RMN3H à l’état solide nous a ainsi permis de mesurer deux distances 3H-3H interatomiques en accord avec les distances de référence connues et obtenues par cristallographie aux rayons X. La troisième molécule identifiée, plus pertinente, comporte un atome de tritium sur un des cycles aromatiques et un autre tritium porté par le carbone en a de l’amine libre de la chaîne peptidique. La synthèse de cette molécule a donc débuté en mettant au point la réaction de marquage au deutérium en faisant varier plusieurs paramètres. Deux méthodologies de synthèse ont été proposées : l’échange isotopique direct sur Phe-Phe et le couplage peptidique de deux entités Phe déjà marquées. Concernant la première méthode, il a été observé un meilleur échange H/D lorsque la réaction est catalysée par les nanoparticules de Ruthénium. Mais la réaction de tritiation, appliquée dans les mêmes conditions, a conduit à un marquage non régiosélectif de la position souhaitée (proton sur le carbone en a de l’amine). Le couplage peptidique, bien que beaucoup plus long en nombres d’étapes et fastidieux, a permis de mettre au point toutes les conditions nécessaires pour mener à bien l’étape de la tritiation et obtenir ainsi la troisième distance intramoléculaire.

La perspective finale du projet est l’obtention de cette troisième molécule de Phe-Phe parfaitement marqué, au tritium, avec une meilleure sélectivité. Il sera question par la suite de procéder à la préparation des cristaux et des nanotubes de Phe-Phe tritiés, travail en collaboration avec le Dr. Maité Paternostre (CNRS UMR 8221/I2BC). Ensuite suivra la RMN du tritium à l’état solide des cristaux et nanotubes de Phe-Phe tritiés, en collaboration avec le Dr. Thibault Charpentier (CEA/IRAMIS). Enfin, le Dr. Yves Boulard (CEA/I2BC) interviendra pour la reconstruction de la structure atomique de Phe-Phe à l’aide de la modélisation moléculaire, en se servant des données obtenues par la RMN tritium à l’état solide et pour terminer, comparer la structure obtenue avec celle de Phe-Phe cristallin déjà connue et décrite dans la littérature. Cette stratégie développée permettra alors d’apporter des informations qui n’ont jamais pu être obtenues par des méthodes classiques pour la résolution structurale d’un large nombre de biomolécules complexes.

Pour l’heure, les résultats obtenus sont très prometteurs. Des manipulations complémentaires sont en cours. Une fois la totalité des résultats obtenus, ils seront publiés et présentés dans des congrès scientifiques.

La résolution structurale de petites molécules dans des complexes supramoléculaires est difficilement accessible aux techniques classiques d’analyse. Nous proposons de développer une stratégie conjuguant chimie de marquage, RMN solide notamment du tritium (3HssNMR) et modélisation moléculaire (MM) pour résoudre ces structures. Notre méthode repose sur : 1) l’identification par MM de positions-clés de marquage ; 2) le marquage chimique (3H, 13C, 15N) des petites molécules ; 3) la formation d’un complexe entre ces molécules et un édifice moléculaire ; 4) la mesure par RMN des distances entre atomes marqués ; 5) à partir de ces distances, la reconstruction par MM de la structure des molécules interagissant avec le système supramoléculaire. Développée pour l’étude de nanotubes peptidiques, cette stratégie sera appliquée à des molécules d’intérêt biologique : molécules anti-amyloïdes, peptides antimicrobiens, ligands de protéines intégrales etc...

Coordinateur du projet

IBITECS - Service de Chimie Bio-organique et de Marquage (Laboratoire public)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IBITECS - Service de Chimie Bio-organique et de Marquage
Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Délégation Régionale Ile-de-France Secteur Sud
IRAMIS - Nanosciences et Innovation pour les Matériaux, la Biomédecine et l'Énergie

Aide de l'ANR 423 000 euros
Début et durée du projet scientifique : novembre 2015 - 48 Mois

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