DS0401 - Etude des systèmes biologiques, de leur dynamique, des interactions et inter-conversions au niveau moléculaire

Holographie tri-dimensionelle pour l’activation parallèle des neurones – 3DHoloPAc

Holographie tri-dimensionnelle pour l’activation parallèle des neurones

3DHoloPAc est la tentative de développer des méthodes récemment proposées par notre groupe (Microscopie à Modulation du Front d’onde, Univ. Paris Descartes) telles que l'holographie générée par ordinateur et le contraste de phase généralisé, pour une photostimulation efficace des neurones. L'objectif est de fournir l'outil approprié pour mieux suivre la complexité 3D du cerveau à une résolution spatiotemporelle élevée, en utilisant l'ingénierie du front d'onde optique en excitation biphotonique.

Activation multi-cellulaire simultanée tridimensionnelle, à la précision de la cellule unique et à une résolution temporelle inférieure à la milliseconde

Le but principal de ce projet est de permettre une activation parallèle en trois dimensions (3D) des neurones par l'utilisation d'approches optogénétiques et de méthodes de mise en forme de la lumière, utilisées pour la génération de motifs étendus qui illuminent simultanément la surface de plusieurs neurones. Nous utilisons l'holographie générée par ordinateur (Computer Generated Holography; CGH) une technique utilisant un modulateur à cristaux liquides pour modifier la phase spatiale de la lumière. Ce projet vise l'extension de cette méthode dans les 3 dimensions (3D), avec un microscope utilisant l’excitation à deux photons. Nous cherchons ainsi à à projeter des motifs d’illumination dans différents plans axiaux dans tout le volume d'excitation réalisable par des objectifs d'ouverture numérique élevée. Les objectifs spécifiques du projet sont les suivants: i) Développer de nouveaux outils pour la stimulation holographique 3D avec des motifs étendus. Au moment de la soumission, l’accés à un volume n’était possible qu’avec des multipoints à la limite de diffraction. ii) Moduler l'intensité des motifs d'excitation, de manière à adapter l’illumination au niveau d'expression des molécules optogénétiques sur les neurones et pour compenser l'inhomogénéité d'intensité due à l'efficacité de diffraction du modulateur de phase sur le champ d'excitation ainsi qu’à la diffusion dans le tissu. iii) Appliquer l'activation optogénétique multicellulaire 3D pour l’activation des cellules dans les tranches de cerveau et dans la rétine.

L'holographie générée par ordinateur est une méthode utilisant un dispositif à base de cristaux liquides, qui module la phase spatiale de la lumière pour réorganiser la lumière dans de multiples spots circulaires de différentes tailles (allant des points à la limite de diffraction jusqu'à de grandes surfaces d'excitation) ou de patrons d’excitation arbitraires. La capacité de projeter des motifs arbitraires 3D, bien que courante pour la projection de points à limite de diffraction, par exemple dans des applications telles que les pinces optiques, n'a jamais été rigoureusement démontrée et exploitée pour des motifs étendus. Cette approche peut être extrêmement bénéfique en neurobiologie, où les réseaux sont développés en trois dimensions. La combinaison de cette technique en excitation à deux photons avec la focalisation temporelle des impulsions laser ultra-courtes, permet de maintenir un bon confinement axial malgré l'étendue latérale des motifs d’illumination.
L'activation neuronale par optogénétique a initialisé une révolution dans le domaine des neurosciences au cours de la dernière décennie vers la stimulation réversible et sélective de populations neuronales spécifiques dans des préparations cérébrales intactes. Les neurones peuvent maintenant être manipulés génétiquement pour exprimer des protéines qui, lors de l'absorption des photons, génèrent des courants électriques transmembranaires.
3DHoloPAc utilise ces techniques de pointe en optique, en génie moléculaire et en neuroscience, dans le but d'offrir aux scientifiques un outil flexible pour l'interrogation et la manipulation complexes de circuits neuronaux.

Nous avons développé un algorithme pour projeter des patrons d’excitations holographiques en 3D dans un microscope utilisant des objectifs d'ouverture numérique élevée, avec une grande précision sur le positionnement axial. Nous avons tout particulièrement étendu cette méthode pour une utilisation avec la focalisation temporelle, qui améliore la résolution axiale des motifs à grande surface, améliorant ainsi la résolution spatiale de la stimulation neuronale. Pourtant, la réalisation expérimentale de la focalisation temporelle, limite la méthode à des patrons d’excitation en 2D. Nous avons proposé une façon unique de surmonter cette limitation: notre système optique permet le déplacement axial à distance des motifs holographiques focalisés en temps, ainsi que la génération de multiples cibles holographiques focalisés temporellement occupant des plans axiaux séparés. Un premier modulateur de phase est initialisé avec des profils de phase contrôlant la distribution transversale de la lumière et un second modulateur de phase, positionné après le réseau de diffraction utilisé pour la focalisation temporelle, traite la position axiale de chaque patron de la distribution transversale de la lumière en appliquant des phases sphériques.
Nous avons également développé des protocoles d'alignement pour les deux modulateurs de phase qui tiennent compte de l'efficacité de diffraction, ainsi que la position sur la valve du modulateur de phase de chaque hologramme correspondant à chaque plan.
Pour notre première utilisation du système, nous avons réalisé la photoconversion, à haute résolution spatiale, des neurones exprimant la protéine Kaede, qui, soumise à la lumière ultraviolette, subit la photoconversion irréversible de la fluorescence verte à la fluorescence rouge. Nous avons également activé des neurones exprimant l’actuateur optogénétique ChR2-H134R-mCherry ainsi que l’indicateur calcique GCaMP5G dans la moelle épinière du poisson-zèbre (Hernandez et al. Nat. Commun. 2016).

Les principaux résultats concernent la démonstration du premier système optique permettant l'éclairage à motifs 3D résolus en profondeur grâce à la focalisation temporelle, développé pour l'excitation neuronale. Cependant, le système peut être utilisé pour bien d’autres applications nécessitant des patrons d’excitations en 3D avec une résolution axiale supérieure.
Pour la seconde partie du projet, nous utiliserons le système, ou ses variantes, dans deux directions: i) l'activation multi-cellulaire biphotonique des neurones exprimant des outils optogénétiques, situés dans différents plans axiaux dans le cortex visuel de la souris et ii) l’activation biphotonique de cellules bipolaires exprimant des outils optogénétiques, tout en surveillant les réponses des cellules ganglionnaires dans la rétine, ce dernier en collaboration avec des chercheurs de l’Institut de la Vision (Paris). Les deux études nécessitent un travail préliminaire pour la préparation biologique, d’abord au niveau moléculaire pour choisir la bonne combinaison d'actuateurs optogénétiques et d’indicateurs calciques, car la détection des réponses cellulaires sera réalisée en imagerie calcique. Nous travaillons actuellement dans cette direction pour tester différentes opsines en termes de niveau d'expression, d'efficacité et de propriétés cinétiques, pour trouver la meilleure combinaison avec l'imagerie calcique. Nous travaillons également sur l'optimisation des protocoles d'injection pour une co-expression efficace dans les neurones de l'opsine et de l'indicateur calcique.
Les expériences proposées ici, menées avec succès, nous encouragent à étendre dans un premier temps les expérimentations chez les animaux anesthésiés, puis, d'exploiter et de développer plus encore l'expertise acquise sur l’expérimentation animale en mouvement libre. Les résultats seront extrêmement importants et utiles dans l'avenir pour l'utilisation des schémas holographiques 3D dans d'autres projets collaboratifs de notre groupe.

Publications dans des revues à comité de lecture:
Hernandez O, Papagiakoumou E, Tanese D, Fidelin K, Wyart C and Emiliani V (2016) Three-dimensional spatiotemporal focusing of holographic patterns Nat. Commun. 7 11928

Conférence Invitée:
E. Papagiakoumou, Multi-plane excitation with depth-resolved holographic patterns, The Brain in Focus: New Approaches to Imaging Neurons and Neural Circuits, Rungsted - North Copenhagen, Denmark, April 17-20, 2016.

Brevet soumis:
V. Emiliani, E. Papagiakoumou, D. Tanese, N. Accanto, E. Ronzitti, Optical system for spatiotemporal shaping the wavefront of the electric field of an input light beam to create three-dimensional illumination, Date of submission: April 7, 2017.

L’utilisation des moyens optiques pour stimuler et surveiller l'activité neuronale dans des préparations de cerveau intact ont fourni beaucoup de lucidité au cours de la dernière décennie en neurophysiologie. Des excitateurs optogénétiques, des sondes d’imagerie calcique ou du potentiel membranaire, et d’autres outils moléculaires qui génèrent une activité localisée, ainsi dans l’espace que dans le temps, dans les systèmes vivants, ont beaucoup contribué à l'adoption de la lumière comme l'alternative aux électrodes pour stimuler ou suivre les réponses neuronales. Malgré la précision en ciblage moléculaire de tous ces outils, la spécificité de la lumière d'illumination est toujours essentielle pour étudier avec succès la communication des neurones dans des réseaux tridimensionnels (3D). Ainsi, des nouveautés sur les méthodes optiques qui améliorent la résolution spatio-temporelle devraient se développer.
3DHoloPAc est une tentative de développer davantage les méthodes que nous avons proposées récemment dans le groupe de Microscopie par Modulation du Front d’Onde à l'Université Paris Descartes, comme l’holographie numérique (Computer-Generated Holography ; CGH) et le contraste de phase généralisé, pour la photoactivation efficace des neurones. L'objectif est de fournir un outil pour mieux suivre la complexité 3D du cerveau avec une haute résolution spatiale et temporelle, à l'aide de l'ingénierie du front d'onde optique en excitation bi-photonique. Plus précisément, nous emploierons CGH, qui utilise des hologrammes de phase générés par ordinateur et adressés sur un modulateur spatial de phase (Spatial Light Modulator; SLM) à la base de cristaux liquides, pour réorganiser la lumière en patrons complexes d’illumination laser. Ce projet porte sur l'adaptation de cette méthode pour la projection simultanée des patrons complexes dans différents plans axiaux dans le volume de l'échantillon. Cette capacité, bien qu’elle soit très commune pour projeter des multi-points limités en diffraction en 3D, surtout pour des applications des pinces optiques, n'a jamais été rigoureusement démontrée ou utilisée pour projeter des patrons de forme arbitraire d’une surface large, une approche extrêmement bénéfique dans la neurobiologie, où les réseaux neuronaux sont développés en 3D. En plus, sa combinaison avec la focalisation temporelle des impulsions laser permettra d’obtenir des patrons d’excitation de très bonne résolution axiale, malgré leur surface étendue.
De plus, nous utiliserons CGH pour moduler l'intensité qui est attribué à chaque motif d’excitation, afin de corriger les inhomogénéités de l’intensité dues à la diffusion de la lumière dans le tissue et à la basse efficacité de diffraction du SLM aux bords du champ d’excitation. De la même manière nous allons aussi homogénéiser la réponse des cellules exprimant les molécules optogénétiques à différents niveaux. La réalisation d'un microscope holographique 3D en excitation bi-photonique permettra une stimulation multi-cellulaire dans des multi-plans, que nous proposons de tester dans la photoactivation de neurones exprimant des molécules optogénétiques dans des tranches de cerveau de la souris et dans la rétine, un système idéal pour ce type de manipulations grâce à sa structure en couches, afin de comprendre comment l’information visuelle est transmise par les cellules bipolaires aux cellules ganglionnaires. La dernière application s’effectuera dans le cadre d’une collaboration avec l’Institut de la Vision à Paris.
Le but ultime est de développer un système capable de s'adapter et de répondre aux besoins de tout type de préparation biologique. L’obtention des résultats positifs nous motivera à étendre l'application de nos méthodes dans le futur pour des expériences ‘in vivo’.
Mon expertise acquise pendant huit ans dans le domaine de la structuration de la lumière en microscopie bi-photonique assure la faisabilité du projet, ainsi que sa réussite.

Coordinateur du projet

Madame Eirini Papagiakoumou (Laboratoire de Neurophotonique)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CNRS Laboratoire de Neurophotonique

Aide de l'ANR 305 859 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2015 - 36 Mois

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