DS0401 - Etude des systèmes biologiques, de leur dynamique, des interactions et inter-conversions au niveau moléculaire

Études stucturales de la protéine Tax du HTLV – SinTax

SinTax : Études stucturales de la protéine Tax d'HTLV

Le virus T-lymphotrope Humain de type 1 infecte 10 à 20 millions de personnes, dans des foyers de forte endémicité. HTLV-1 est l’agent étiologique de la leucémie T de l'adulte et d'une maladie neurodégénérative. La protéine virale Tax joue un rôle clé dans la pathologie, en permettant une transcription virale efficace et en modifiant la signalisation cellulaire. Ce projet vise à obtenir des données structurales de la protéine Tax, seule ou en complexe avec certains de ses partenaires cellulaires

Tax, une cible thérapeutique multiforme ?

La protéine virale Tax joue un rôle clé dans la pathogénicité d'HTLV-1. Résoudre sa structure atomique ouvrirait des pistes pour le développement de nouvelles thérapies anti-HTLV-1. Cependant, du fait des ses multiples fonctions, il est probable que Tax possède des conformations différentes selon le partenaire biologique avec lequel elle interagit. C’est pour cela que notre projet vise aussi à réaliser l’étude structurale de Tax en complexe avec différents partenaires cellulaires impliqués dans ses fonctions, à savoir : i) le facteur de transcription CREB, avec lequel Tax interagit pour activer la transcription du promoteur viral et ii) la sous unité p65/RelA de la famille NF-kB, avec laquelle Tax interagit pour activer la voie de signalisation canonique de la voie NF-kB, impliquée dans la transformation des cellules infectées. <br />Du fait du rôle central de Tax dans l’infection par HTLV-1 et dans la pathogénicité virale, résoudre la structure 3D de Tax, seule ou en complexe avec certains de ses partenaires cellulaires, représentera un succès majeur. En effet, ceci permettra à long terme le développement de stratégies thérapeutiques anti-HTLV-1 ciblant la protéine Tax. <br />Résoudre la structure 3D de Tax en complexe avec ses partenaires cellulaires donnera aussi des informations importantes en dehors de l’étude d'HTLV-1. En effet, ceci permettra de comprendre comment une protéine virale peut détourner de nombreux partenaires cellulaires alors qu’elle ne fait que 350 acides aminés de long. Comprendre comment une protéine peut s’adapter à différentes fonctions malgré ses contraintes structurales sera d’un intérêt certain pour l’étude de toutes les protéines adaptatives qui sont présentes dans les organismes, les pathogènes, et/ou qui sont impliquées dans les interactions hôte/pathogène.

La protéine Tax et ses partenaires cellulaires sont co-exprimés dans un système procaryote pour purifier les complexes natifs. Ces complexes sont utilisés pour effectuer en parallèle des études structurales par cristallographie aux rayons X et par microscopie électronique. Le criblage des conditions de cristallisation est effectué à l’aide d’un nanopipetteur Mosquito et d’hôtels à cristaux à 19°C et 4°C (Formulatrix, ExploraNova). L’optimisation des conditions de cristallisation ainsi identifiées sera faite manuellement. La diffraction des cristaux obtenus sera effectuée aux synchrotrons de Grenoble, France (ESRF) et Villigen, Suisse (PSI) auxquels le consortium a un accès régulier.
La microscopie électronique (EM) sera utilisée pour déterminer la structure des différents complexes. En effet, il est possible d’obtenir la structure 3D de petits complexes par cryo-EM grâce à l’utilisation d’un détecteur direct sur un Polara EM (équipe 3). Si la cryo-EM n’aboutit pas, nous utiliserons l’EM en coloration négative pour déterminer l’enveloppe des complexes. Les structures à haute résolution des différents partenaires seront replacées dans les densités obtenues par EM. Ces résultats d’EM peuvent s’avérer décisifs si l’obtention de cristaux de complexes s’avère une étape limitante. La structure du complexe Tax/CREB sera également étudiée en présence de leur ADN cible de 21pb, le TxRE (Tax Responsive Element) du promoteur viral, afin d’obtenir une vue du complexe ternaire fonctionnel, en comparaison avec la structure connue du complexe CREB/ADN en l'absence de Tax.
L’importance des résidus présents aux différentes interfaces que nous identifierons dans les structures 3D de Tax en complexe avec ses partenaires sera vérifiée par des expériences de mutagenèse dirigée, basées sur des modélisations structurales. Ces mutants seront utilisés dans des tests fonctionnels afin de caractériser précisément les résidus et interfaces indispensables aux fonctions de Tax.

Nous avons tout d’abord exprimé Tax seule, en système procaryote. Après purification, une analyse par microscopie électronique en coloration négative a suggéré que Tax était en complexe avec la protéine chaperonne bactérienne GroEL. Des expériences de cristallographie aux Rayons X sur les mêmes échantillons ont permis l’obtention de données de diffraction à ~4Å de résolution. Ces données sont actuellement en cours d’analyse afin d’évaluer si la protéine Tax est présente dans le cristal et, le cas échéant, d’effectuer les premières études structurales de la protéine.
Nous avons co-exprimé la protéine Tax avec la sous-unité p65 de NF-kB. Les conditions permettant la co-expression de ces deux protéines ont été explorées, mais la purification s’est avérée difficile du fait des étiquettes utilisées. Des expériences sont en cours pour évaluer la co-expression de p65 et de Tax avec des étiquettes différentes.
Nous avons également effectué la co-expression de Tax avec le facteur de transcription CREB. Dans ces conditions, la purification de la protéine Tax permet de co-purifier la protéine CREB, démontrant la présence du complexe Tax/CREB et sa purification partielle. De plus, ce complexe semble fonctionnel, car des expériences de retard sur gel montrent l’interaction de ce complexe avec l’ADN viral cible. Cependant, les complexes ainsi obtenus ne sont pas suffisamment purs pour des études structurales. D’autres essais de purification de ce complexe sont en cours, dont des essais de purification du complexe Tax/CREB en présence de l’ADN viral cible TxRE, qui a été décrit comme augmentant l’affinité du complexe Tax/CREB.
Enfin, le projet a été étendu à l’étude de la protéine Tax en complexe avec UPF-1, une hélicase cellulaire de structure connue. Ce complexe peut être purifié sous forme active en petites quantités. Une augmentation des volumes est donc actuellement en cours, afin d’obtenir suffisamment de complexes Tax/UPF1 pour effectuer les études structurales.

Nous sommes assez confiants quant à l’obtention de complexes de Tax avec différents partenaires cellulaires dans les limites du financement de ce projet. Les différentes approches que nous avons développées devraient ainsi permettre d’atteindre notre objectif, qui est d’obtenir les premières données structurales de la protéine Tax du virus HTLV-1.
De plus, l’étude structurale des complexes Tax/UPF1 qui a été ajoutée il y a quelques mois va permettre d’augmenter nos chances d’obtenir un complexe permettant d’élucider la structure de la protéine Tax.
Enfin, l’obtention très récente de données structurales de complexes Tax/GroEL pourrait nous permettre d’obtenir rapidement des premières informations structurales de Tax et donner des pistes pour de premiers essais de mutagenèse dirigée de Tax, afin de caractériser les relations structures/fonctions de cette protéine.

aucune

Les virus de la Leucémie Humaine à cellules T (HTLV-1 à -4) infectent plus de 20 millions de personnes dans le monde. Les plus fréquents sont HTLV-1 et -2. HTLV-1 est l'agent étiologique de la leucémie T de l’adulte (ATL) ainsi que d'une maladie neurodégénérative nommée Paraparésie Spastique Tropicale/Myélopathie Associée à HTLV-1 (TSP/HAM). Le virus HTLV-2, apparenté à HTLV-1, n'induit en revanche qu'une lymphocytose persistante. La protéine Tax des virus HTLV est une protéine transactivatrice nécessaire à l'activation de la transcription virale. Tax active également plusieurs voies de signalisation (par exemple NF-kB), menant à une altération de la transcription de gènes cellulaires associée à la pathogenèse viro-induite. Les protéines Tax de HTLV-1 (Tax-1) et de HTLV-2 (Tax-2) ne fixent pas les mêmes facteurs de transcription NF-kB, ce qui pourrait expliquer les différences observées de pathogenèse. Tax est exprimé in vivo et représente donc une cible intéressante pour le développement de molécules anti-HTLV, mais sa structure reste inconnue.
Ce projet vise à obtenir les premières structures tridimensionnelles expérimentales des protéines Tax-1 et Tax-2, seules ou en complexe avec des facteurs de transcription cellulaires interagissant avec Tax-1 et/ou Tax-2.
Ainsi, nous caractériserons par cristallographie aux rayons X la structure atomique des protéines Tax-1 et Tax-2 entières ou sous forme de domaines. Les domaines fonctionnels de facteurs de transcription cellulaires interagissant avec Tax-1 et/ou Tax-2 seront également produits dans deux systèmes d’expression (E. coli, cellules de mammifère). Les facteurs de transcription sélectionnés pour cette étude sont CREB, p65/RelA et NF-kB2/p100, qui sont respectivement impliqués dans trois fonctions de Tax: la transactivation virale, l'activation de la voie canonique de signalisation NF-kB, et l'activation de la voie non canonique NF-kB. Des structures atomiques sont déjà disponibles pour les domaines fonctionnels de ces trois partenaires cellulaires de Tax.
Après expression des protéines individuelles, les complexes entre les protéines Tax et les facteurs cellulaires seront caractérisés par des méthodes biophysiques et biochimiques classiques. Ces complexes macromoléculaires seront alors étudiés par cryo-microscopie électronique pour obtenir leurs enveloppes à résolution moyenne, dans lesquelles nous placerons les structures à haute résolution des différents composants des complexes, y compris les structures de Tax que nous aurons obtenues. Les complexes entre les protéines Tax et CREB seront également étudiés en présence de l’ADN viral cible (séquence TxRE du LTR viral) afin d’obtenir des informations structurales sur le complexe fonctionnel qui initie l'activation de la transcription d'HTLV en recrutant Pol II sur le promoteur viral.
Les structures de ces complexes macromoléculaires, combinées à leur caractérisation biophysique et biochimique, seront utilisées pour déterminer les interfaces protéine:protéine et protéine:ADN impliquées dans les fonctions de Tax. La pertinence de ces interfaces sera vérifiée par mutagenèse dirigée de Tax basée sur ces données structurales. L’impact des mutations sera évalué dans des tests fonctionnels in vitro pour valider nos observations. Ceci permettra l’identification précise des résidus et interfaces requis pour les fonctions de Tax.
Cette étude permettra donc d’identifier précisément les mécanismes moléculaires impliqués dans les fonctions de Tax à la fois au niveau de la transactivation du promoteur viral (complexe Tax/CREB) et au niveau de la transformation cellulaire induite par Tax (complexes Tax/ NF-kB). La compréhension de ces mécanismes pourra ouvrir la voie au développement rationnel de molécules thérapeutiques anti-HTLV-1 ciblant Tax. Plus généralement, cette étude fournira de nouveaux éclairages sur la façon dont les protéines virales peuvent faire preuve d’adaptabilité malgré les contraintes structurales qu’elles subissent.

Coordinateur du projet

Monsieur Christophe GUILLON (Bases Moléculaires et Structurales des Systèmes Infectieux)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

UMR 5075 Institut de Biologie Structurale (IBS)
U1111-CIRI Centre International de Recherche en Infectiologie
BMSSI-CNRS Bases Moléculaires et Structurales des Systèmes Infectieux

Aide de l'ANR 357 760 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2015 - 36 Mois

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