Flash Info
Publication du programme PAUSE – ANR Ukraine pour l’accueil de scientifiques ukrainiens et ukrainiennes dans des laboratoires français
DS0401 - Etude des systèmes biologiques, de leur dynamique, des interactions et inter-conversions au niveau moléculaire

Le pont tournant: structure et dynamique de site de contact entre membranes formés par l’échangeur OSBP de stérol/PI(4)P. – SwingBridge

SwingBridge

The bridge and the shuttle : structure and dynamics of the membrane contact site formed by the sterol/PI(4)P exchanger OSBP

enjeux et objectf projet swingbridge

The overall goal of the project is to obtain the first 3D functional structural and dynamical model of OSBP in MCS. We want to highlight two particularly innovative aspects of this project. The first is the use of cryo-EM to determine the MCSs structure. Cryo-EM will provide 3D models of both proteins and membrane otherwise difficulty to build from classical approaches of structural biology. The second innovative aspect is the design and the use of new and dedicated in vitro systems to analyze the dynamic of assembly/disassembly based on giant unilamellar vesicle (GUV). We want to answer to the following 3 questions: 1. What are the key elements for the functional and structural architecture of OSBP-MCS ? Using chosen constructs, the role of each protein element will be assigned by combining approaches of cell biology, in vitro functional studies with membrane models and cryo-EM. 2. What is the structure of OSBP-MCS? Several atomic models of parts of OSBP or other ORP/Osh proteins, as well as of the cytoplasmic domain of VAP-A are known. However, the structure of full-length OSBP and even more, OSBP in interaction with full-length VAP-A F between two facing membrane is lacking. Thus the functional architecture of OSBP in MCS is unknown and only putative models are used to conduct in cellulo and in vitro experiments. We have obtained a first visualization of a MCS by cryo-electron tomography (cryo-ET) that validated the feasibility of the cryo-EM reconstruction. 3. What is the dynamics of assembly and disassembly of MCS? A specificity of OSBP-MCS and likely of other ORPs is that the existence of MCS is directly coupled to the transport of lipids. This coupling involves the diffusion and assembly, including that of VAP-A F in the membrane, of the constitutive proteins and transported lipids as of the internal dynamics of the ORD domains. We will combine reconstitution of MCS in micron sized GUV and use fluorescence microscopy and FRAP measurements.

we will explore OSBP-mediated MCS by two approaches: 1. Cryo-EM to get structural information (Partner 1). The goal is to determine the first 3D model of MCS. 2. Real time measurements to get information on dynamics of assembly/disassembly of MCS and of lipid transfer (Partner 2). In both cases, we will design new in vitro membrane systems. We rely on our complementary expertise in cell biology, membrane biochemistry and structural biology as well as on solid preliminary data.

expériences en cours

Contacts between cellular compartments membranes and especially between the ER where lipid are synthetized and other organelles are identified and their major role in lipid homeostasis is accepted. Disorders of this great cell function are increasingly cited in serious human diseases and some involved proteins are already identified as target of pharmacophores. The clinical translation is not yet accomplished and the field continuously feeds of fundamental advances. There is a network of results concerning various proteins involved in the MCS and structural and functional homologies are being understood. This project addresses two issues that hinder the understanding of the dual function of MCSs between ER and trans-Golgi. First visualizing, at the molecular level, these MCSs must fill the incomplete 3D models built on atomic data of sub-domains and establish the structure-function relationships necessary to understand the roles of each protein component in the tethering and in the transport of lipids. Second, this 3D model only makes sense if it is correlated with the dynamics, at the molecular level, of assembly and disassembly of MCSs which is a key element of their function during cell life. These two issues are common to other MCSs and given the strong homology between lipid transfer proteins, it is very likely that our results will be universal.

en preparation

La compartimentalisation cellulaire est une caractéristique des cellules eucaryotes. Elle permet de confiner des fonctions spécialisées dans un environnement spécifique. Toutefois, elle implique également l'échange de matériel entre les compartiments. Le trafic intracellulaire médié par des vésicules contribue à ces échanges et les mécanismes associés ont été compris (Prix Nobel de physiologie et de médecine 2013). Un autre mécanisme implique la formation de jonctions de membrane entre organites qui communiquent sans fusion de la membrane. Ces jonctions (<30 nm) ou sites de contact de la membrane (MCS), sont d'une importance capitale pour le transport intracellulaire de lipides. Ils jouent également un rôle dans la signalisation intracellulaire, l’héritage d’organite et le métabolisme des lipides et ont reçu une attention considérable au cours des dernières années en raison de leur implication dans plusieurs maladies métaboliques.
Les MCS sont conservées dans toutes les cellules eucaryotes et unifient le réticulum endoplasmique (RE) avec d'autres organites. Un lipide bio-synthétisé dans l’RE peut atteindre rapidement un autre organite par le trafic à travers un MCS. Les protéines de transfert de lipides présents dans MCS ont été récemment identifiées comme des cibles intracellulaires de plusieurs composés anticancéreux et antiviraux et certains agents pathogènes bactériens intracellulaires détournent ces protéines pour leurs propres activités de transport des lipides.
Des études de biologie cellulaire et de microscopie électronique ont défini les principales caractéristiques de MCS: 1. Les MCS sont associés à des fonctions spécifiques, y compris le transfert de lipides, de calcium ou de signalisation de l'apoptose. 2. Les MCS consistent en des assemblages de protéines intégrales ou liées à la membrane présentes sur chaque face des membranes et jointes par des domaines cytoplasmiques. 3. MCS sont dynamiques et régulés.
Les défis actuels en matière de recherche MCS sont clairement identifiés. Au niveau structural, la structure de certaines protéines ou des domaines individuels solubles est disponible, mais l'architecture complète de MCS est inconnue. La cryo-microscopie électronique (cryo-EM), l'expertise du partenaire 1 (Institut Curie, Paris), est probablement l’approche structurale la plus appropriée pour visualiser le complexe protéique entre deux membranes. Les avancées de cette approche permettent aujourd’hui de s’attaquer à des complexes protéiques comme les MCS. Au niveau fonctionnel, la dynamique et la réglementation de ces jonctions restent à explorer. La résolution de ces deux questions nécessite la conception de nouveaux essais in vitro et in cellulo.
Le Partenaire 2 (IPMC, Valbonne) a récemment reconstitué les premiers MCS fonctionnels (Mesmin, Cell, 2013). Ce MCS joint L’ER et le trans-Golgi et est constitué d'un complexe entre la protéine de liaison d’oxystérols (OSBP), la protéine VAP-A du RE et la protéine Arf1-GTP du Golgi.
Partant de ce constat, nous allons explorer la fonction double du MCS de jonction et de transport de lipides par deux approches: 1. La cryo-EM pour déterminer le premier modèle 3D de MCS (Partenaire 1). 2. Les mesures en temps réel pour obtenir des informations sur la dynamique d’assemblage/désassemblage des MCS (Partenaire 2). Pour cela, nous allons concevoir des systèmes in vitro inédits. La compréhension des principes fonctionnels et structurels qui sous-tendent l'action d’OSBP aura un impact général sur les MCS étant donné la conservation de domaine entre les protéines de transfert de lipides. Les outils et les concepts développés ici vont également enrichir la vision de la dynamique des compartiments intracellulaires et devraient stimuler les recherches en thérapies pharmacologiques des maladies associées. Cette proposition est donc en accord avec les objectifs du "Défi 4, Axe 1" de décrypter les mécanismes multi-échelles spatiales et temporelles de la cellule.

Coordinateur du projet

Monsieur Daniel Lévy (INSTITUT CURIE - SECT DE RECHERCHE)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IPMC Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire
INSTITUT CURIE - SECT DE RECHERCHE

Aide de l'ANR 426 709 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2015 - 36 Mois

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