DS0401 - Etude des systèmes biologiques, de leur dynamique, des interactions et inter-conversions au niveau moléculaire

Rôle de la nano-organisation spatio-temporelle dans la régulation de la spécificité de la voie de signalisation JAK/STAT – NANOSTAT

Rôle de la nano-organisation spatio-temporelle dans la régulation de la spécificité de la voie de signalisation JAK/STAT

Nous proposons que la spécificité de signalisation des récepteurs des interférons (IFN-R) dépend de la nano-compartimentation à la membrane plasmique et dans les endosomes. Nous étudions les IFNR (alpha / beta) et (gamma), car tous deux activent la phosphorylation de STAT1, mais par des mécanismes distincts. Nous proposons que la localisation des IFNRs dans des nano-compartiments de la membrane plasmique et la régulation spatio-temporelle du trafic endosomal contrôlent la signalisation JAK/STAT.

Comment la spécificité de la signalisation JAK/STAT est contrôlée par nano-compartimentation des IFN-R avec le complexe de signalisation JAK / STAT au niveau de la membrane plasmique et des endosomes.

Nous dévoilerons les déterminants de l'assemblage et du trafic endosomal des IFN-Rs de type I (IFNAR) et II( IFNGR). Nous proposons que les IFNR de type I (IFN alpha/beta) et de type II (IFN gamma) représentent l'un des meilleurs paradigmes pour étudier la complexité de ces mécanismes puisque IFNAR et IFNGR activent une molécule STAT1 commune mais contrôlent une sortie transcriptionnelle différente. <br /> <br />La combinaison de tests de biologie cellulaire avec des approches biophysiques et photoniques uniques nous offre une opportunité unique de tester notre hypothèse clé que la localisation et le regroupement des complexes de signalisation des récepteurs IFN en nano-compartiments membranaires distincts (membrane plasmique pour IFNGR et endosome précoce pour IFNAR) associés à la régulation spatio-temporelle distincte du trafic endosomal des IFN-Rs conditionnent sélectivement le mécanisme de l'activation de JAK/STAT. <br /> <br />La philosophie de notre projet réside dans l'émergence de nouveaux concepts basés sur la quantification d'observables biologiques à un niveau de molécule unique grâce au développement d'outils expérimentaux et analytiques innovants. En fin de compte, nous nous attendons à dévoiler les bases moléculaires qui conditionnent la réactivité et la dynamique des macromolécules biologiques (IFN-Rs) et de leurs complexes (partenaires cytosoliques JAK/STAT) lorsque les cellules sont activées par les différents IFNs. Ainsi, il existe un lien intrinsèque inhérent à ce projet qui regroupe trois domaines de recherche différents, à savoir la biologie cellulaire, les systèmes de modèles membranaires in vitro et la photonique, aux niveaux conceptuel et expérimental.

Nous identifierons les différences spécifiques entre l'assemblage et la dynamique de l'IFNAR et de l'IFNGR à la membrane plasmique et aux endosomes en utilisant des techniques d'imagerie à molécule unique et à super-résolution. Le rôle de la micro-compartimentation de la membrane plasmique dans des nano-domaines à base d'actine et de lipides sera étudié en utilisant des modifications biochimiques et génétiques. Plus précisément, nous cherchons à déterminer comment les caractéristiques spécifiques de la localisation de l'IFNGR dans les nanodomaines lipidiques sont probablement liées à des interactions spécifiques entre lipides membranaires et galectines extrcellulaires. Pour une compréhension détaillée des interactions moléculaires impliquées dans la formation du complexe de signalisation, nous identifierons les partenaires d'interaction potentiels par spectrométrie de masse (P1), qui sera validée dans les cellules vivantes par micro-patterning de surface fonctionnelle. Le rôle de ces partenaires d'interaction sera encore appréhendé par des études biophysiques et fonctionnelles (P1). Sur la base de l'image mécanistique détaillée obtenue à partir de ces études, nous tenterons d'échanger systématiquement des modules fonctionnels entre les récepteurs IFN de type I et de type II afin de valider leur pertinence fonctionnelle dans un contexte cellulaire spécifique.

P1 a étudié la mutation IFNGR2 T168N, qui ajoute un néo-glycane sur IFNGR2 et bloque l'activité IFN-gamma (Nat Genet 2005). P1 a montré que la diffusion latérale d'IFNGR2 est confinée par des nanodomaines de sphingolipides/cholestérol alors que celle d'IFNGR2 T168N est confinée par des nanodomaines d'actine où l'activation de JAK/STAT par IFN-gamma est inhibée. L'élimination des galectines liées à l'IFNGR2 T168N rétablit la diffusion latérale dans les nanodomaines lipidiques et l'activation de JAK/STAT. Ces expériences établissent le rôle physiologique des nanodomaines lipidiques dans la signalisation des récepteurs in vivo (Cell 2016).

P1 a étudié le rôle du trafic endosomal et a trouvé que les sous-unités IFNAR1 et IFNAR2 du complexe IFNAR sont triées différentiellement par le rétromère à l'endosome précoce. Ces données établissent le rétromère comme un régulateur spatio-temporel clé du tri endosomal IFNAR et de la signalisation JAK/STAT (Nat Commun 2016).

P2 a étudié la dynamique spatio-temporelle d'IFNAR et IFNGR à la membrane plasmique (MP) par suivi de molécule unique. Des IFN marqués par fluorescence ont été produits. L'imagerie à molécule unique a révélé une faible densité de complexes de signalisation pour les deux IFN-R et une distribution et diffusion aléatoires à la MP. L'imagerie à molécule unique bicolore des sous-unités IFN-R marquées a montré qu'elles ne sont pas pré-dimérisées ou pré-organisées spatialement. Alors que des paramètres de diffusion similaires ont été obtenus pour IFNGR2 wt et T168N en l'absence de ligand, le mutant n'est pas été recruté dans le complexe de signalisation.P2 a établi l'imagerie à molécule unique à 4 couleurs pour suivre la diffusion et l'interaction de toutes les sous-unités IFN-R.

Des protéines de fusion pour imager le recrutement STAT1 et STAT2 à haute résolution ont été produites avec des marqueurs endosomaux fluorescents. Le principe a été validé pour le trafic des IFN-Rs par microscopie à feuillets de lumière.

Nous suivrons le programme de travail original en mettant l'accent sur les expériences restantes qui nécessitent une collaboration entre les deux groupes. Nous allons maintenant étudier le rôle des protéines liant l'actine et des connecteurs d'actine aux récepteurs qui ont été révélés par spectrométrie de masse par P1. P2 examinera également le rôle des galectines dans la diffusion et l'interaction des IFNR au niveau de la membrane plasmique puisqu'elles ont été trouvées associées à IFNGR2 par protéomique cellulaire et comme régulateurs de l'activation de JAK/STAT par IFN-gamma (Cell 2016).

P2 tirera parti de l'étiquetage et de l'imagerie tridimensionnelle par microscopie à feuillets de lumière établis dans son laboratoire en combinaison avec le dSTORM pour résoudre l'organisation et la dynamiques spatio-temporels des récepteurs dans les endosomes.

Dans un autre effort de collaboration, nous étudierons et validerons par des techniques avancées d'imagerie de fluorescence les interacteurs potentiels identifiés par P1 par protéomique. Cette validation sera réalisée par micropatterning cellulaire récemment mis en place par P2 (JCB 2014). Grâce à la redistribution spatiale des protéines appât à la MP au moyen de substrat micropatternés, des interactions avec des protéines appât fluorescentes peuvent être détectées sans ambiguïté et quantifiées dans les cellules vivantes. L'assemblage de complexes de signalisation actifs dans des micromotifs est actuellement utilisé pour détecter et quantifier le recrutement des effecteurs afin de sélectionner les sondes les plus appropriées pour suivre l'activation des récepteurs au niveau de la molécule unique. Au moyen de la microscopie à feuille de lumière en treillis, P2 va analyser les interactions effectrices au niveau de la membrane plasmique et dans les endosomes pour comparer les efficacités d'activation du signal dans les différents nanocompartiments cellulaires.

1. Chmiest, D., Sharma, N., Zanin, N., Viaris de Lesegno, C., Shafaq-Zadah, M., Sibut, V., Dingli, F., Hupé, P., Wilmes, S., Piehler, J., Loew, D., Johannes, L., Schreiber., G and C. Lamaze. 2016. Spatiotemporal Control of Interferon-induced JAK/STAT Sig

La propagation du signal induite par le ligand lié aux récepteurs spécifiques de la membrane plasmique est un processus clé pour que la cellule puisse remplir son rôle complexe dans les organismes multicellulaires. Alors que les principaux paradigmes de ce processus ont été établis pour différents types de récepteurs, les paramètres moléculaires et biophysiques qui contrôlent la spécificité de l'activation du signal par le ligand restent obscurs. Le challenge est de comprendre le « paradoxe de la signalisation » où un ensemble limité d'effecteurs intracellulaires peut contrôler des myriades de signaux. Ce paradoxe est particulièrement bien illustré par le récepteur de l'interféron de type I (IFNAR) où près de 13 IFNs différents peuvent activer le même récepteur de l’IFN alpha. Les interactions latérales complexes entre protéines membranaires intégrales de la bicouche lipidique sont censées jouer un rôle important pour l'activation du récepteur par ses ligands. En plus de ces interactions dans la membrane plasmique, la dynamique des endomembranes peut aussi jouer un rôle clé dans l'activation sélective des récepteurs de signalisation.

L'objectif global de ce projet collaboratif et transdisciplinaire est de découvrir comment la spécificité de la signalisation JAK/STAT est contrôlée par la nano-organisation du complexe IFNR activé à la membrane plasmique et dans l’endosome. Les IFNRs représentent l'un des meilleurs paradigmes pour étudier la complexité de ces mécanismes puisque les IFNRs de types I IFNAR (IFN alpha/beta) et de type II IFNGR (IFNgamma) activent une molécule d'STAT1 commune, mais contrôlent une des voies de transcription distinctes. P1 a récemment montré que le transport et l’endocytose des IFNRs endocytose ainsi que la nano-organisation des lipides à la membrane plasmique jouent un rôle clé dans la sélectivité de l'activation JAK/STAT par les IFNs de type I et de type II, respectivement. P2 a établi des techniques d'imagerie de pointe pour détecter l’assemblage et la dynamique spatio-temporelle des IFNRs en utilisant la microscopie à super-résolution et à molécule unique. Le rôle de la nano-compartimentation de la membrane plasmique par l’actine et les nanodomaines lipidiques sera exploré en utilisant des modifications biochimiques et génétiques. Plus précisément, nous déterminerons comment les caractéristiques de localisation de IFNGR dans les nano-domaines lipidiques spécifiques, sont probablement liée à des interactions de lipides et de galectines spécifiques. Nous identifierons de nouveaux partenaires d'interaction par spectrométrie de masse (P1), que nous validerons sur cellules vivantes par « micropatterning de surface fonctionnelle » (P2). Le rôle de ces partenaires d'interaction sera détaillé par biophysique (P2) et des études fonctionnelles (P1).

La combinaison de la biologie cellulaire (P1) avec la biophysique et des approches avancées de photonique (P2) offriront l'occasion unique de tester l'hypothèse provocatrice que la localisation et l’agrégation du complexe IFNR activé dans des nano-compartiments membranaires distincts (membrane plasmique pour IFNGR et endosome précoce pour IFNAR) conjointement avec des différences de régulation spatio-temporelle du trafic endosomal de IFNR conditionnent sélectivement l'activation mécanistique de la voie JAK/STAT.

La philosophie du projet réside dans l'émergence de nouveaux concepts basés sur la quantification des observables biologiques à un niveau moléculaire unique à travers le développement d'outils innovants expérimentaux et analytiques. Nous démêlerons la base moléculaire qui conditionne la réactivité et la dynamique des macromolécules biologiques (IFNRs) et des complexes associés (JAK/STAT) lorsque les cellules sont activées par les IFNs. Ainsi, un lien intrinsèque rassemble trois domaines de recherche différents : la biologie cellulaire, les systèmes modèles in vitro de la membrane et la photonique, tant au niveau conceptuel qu’expérimental.

Coordinateur du projet

Monsieur Christophe Lamaze (INSTITUT CURIE - SECT DE RECHERCHE)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

INSTITUT CURIE - SECT DE RECHERCHE
UOS University of Osnabrück

Aide de l'ANR 227 240 euros
Début et durée du projet scientifique : novembre 2015 - 36 Mois

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