Fidélité et structure du ribosome étudiée par analyse aux rayons X. – RFS

La cristallographie par diffraction des rayons X est une technique expérimentale permettant de déterminer l’arrangement spatial des atomes dans un cristal, par l’intermédiaire d’un faisceau de rayons X projeter sur le cristal induisant un phénomène de diffraction dans différentes directions.
Cependant, la principale limitation des études cristallographiques réside dans l’obtention de cristaux capables de diffracter, par ailleurs, les informations de dynamique de la molécule restent limitées à partir d’une seule et même expérience de diffraction.
La cible principale de notre projet est le ribosome, le plus gros complexe macromoléculaire retrouvé au sein des cellules. Le ribosome doit d’abord être cristallisé afin de déterminer sa structure, durant de nombreuses années il n’y avait pas de cristaux capables de diffracter. Nous sommes la première équipe à avoir résolu la structure du ribosome bactérien dans son état fonctionnel. La préparation de chaque nouveau type de cristaux (par exemple du ribosome avec un inhibiteur ou un ligand fonctionnel) peut prendre plusieurs mois et parfois des années. Une complication supplémentaire provient du fait que les cristaux de ribosome, comme souvent constaté en cristallographie de l’ARN, diffractent faiblement ayant pour conséquence des cartes de densité électronique parfois imprécises et difficiles à interpréter.

Au cours des 18 premiers mois, nous avons réalisé notre étude de la structure de l'activité inhibitrice de l'aminoglycoside pendant la synthèse des protéines. Dans les eucaryotes, l'effet des aminoglycosides sur la terminaison de la traduction en fait des médicaments puissants pour le traitement de maladies humaines associées à des codons de terminaison prématurés (PTC). Application aminoglycosides pour la thérapie de suppression est limitée par leur toxicité et faible efficacité de la lecture. De nombreuses tentatives ont été faites pour synthétiser des dérivés plus puissants. Mais actuellement les détails moléculaires de l'action des aminoglycosides dans les eucaryotes sont absents. Par conséquent, nous avons effectué des expériences utilisant la cristallographie aux rayons X pour étudier les interactions des aminoglycosides avec le ribosome eucaryote 80S entier. Des structures cristallines pour le ribosome 80S dans le complexe avec la paromomycine, la gentamicine et le TCOO7 (composé à lecture directe de PTC, qui combine des caractéristiques chimiques de la kanamycine et de la néomycin) ont été résolues à 3,3-3,7 Å. Nous démontrons le mode d'action multidimensionnel des aminoglycosides sur la traduction chez les eucaryotes. L'analyse structurale des aminoglycosides en complexe avec le ribosome 80S eucaryote aidera à concevoir de nouveaux dérivés qui sont plus efficaces dans la lecture PTC et dépourvus d'effets toxiques.

Nous avons poursuivi les recherches en utilisant des méthodes de spectrométrie de masse dédiées afin de détecter et d'analyser les modifications des nucléotides sur les ARNt. Nous nous sommes concentrés sur les ARNt d'Archaea, esp. Thermophiles. En effet, il n'existe pas d'ensemble complet d'ARNt modifiés dans aucun Archéum. Nous avons déjà observé des modifications très inhabituelles ainsi que des localisations de mutations connues.

L'objectif global de notre recherche sera de comprendre comment la structure atomique du ribosome (procaryotes ou eucaryotes) détermine finalement sa fonction. Une compréhension complète de la synthèse protéique nécessite la connaissance de la structure de complexes fonctionnels du ribosome entier dans leur contexte biologique réel.

La majorité des antibiotiques inhibant la traduction cible le ribosome bloquant la traduction à différentes étapes, couvrant l’initiation, l’élongation, la terminaison et le recyclage. L’analyse et la comparaison des sites de liaisons de différents composés entre le ribosome bactérien et eucaryotes à l’échelle atomique fournira de précieux renseignements pour le développement de médicaments ciblant les virus, les protozoaires, les champignons et les bactéries.
L’élucidation des mécanismes de la biosynthèse des protéines au sein du ribosome nous apportera la connaissance des mécanismes moléculaires impliqués par exemple, dans le vieillissement ou les maladies liées à l’apparition de protéines tronquées (anormales).

Rozov A et al (2016) Nucleic Acids Res, 44(13):6434-41.
Rozov A et al (2016) Trends in Biochem. Sci, 41(9): 798-814.
Rozov A et al (2016) Nature communications, 7:10457.
Khusainov I et al (2016) Nucleic Acids Res, 44(21): 10491-10504.
Prokhorova I et al (2016) Scientific reports, 6:27720.
Melnikov S et al (2016) J. Mol. Biol., 428:3570-3576.
Maillot J et al (2016) J. Mol. Biol. , 428:2195-2202.
Yusupova G and Yusupov M (2016) Phil.Trans. R. Soc. B 372: 20160184.
Pellegrino S and Yusupova G (2016) Cell Chem Biology, 23, 1319-1321
Westhof, E. (2016) Methods Mol Biol, 1320, 3-8.
Miao Z and Westhof E (2016) Nucleic Acids Res, 44, W562-567.
Grosjean H and Westhof E (2016) Nucleic Acids Res, 44, 8020-8040.
Costa M et al (2016) Science, 354.
Autour A et al (2016) Nucleic Acids Res, 44, 2491-2500.

La synthèse des protéines est un processus cellulaire hautement régulé qui affecte la croissance, la reproduction et la survie en réponse aux indices intrinsèques et extrinsèques. La fidélité de la traduction assure la production du protéome stable et fonctionnel dans les cellules procaryotes et eucaryotes, mais ce n’est pas un processus biologique exempt d'erreur. Les mécanismes moléculaires responsables des différences de longévité entre les organismes vivants sont en grande partie inconnue, mais il a été montré que c’est lié à la fidélité / l’exactitude de la traduction des protéines. Les études structurales des mécanismes de fidélité de la traduction à l'échelle atomique chez les organismes eucaryotes font défaut parce que le ribosome eucaryote 80S est beaucoup plus important et plus complexe que son homologue bactérien. A l'heure actuelle, une seule technique permet d’obtenir des informations structurales à haute résolution à l’échelle du ribosome : la cristallographie par diffraction des rayons X.
Notre objectif principal est de comprendre au niveau atomique les mécanismes moléculaires de la fidélité de la traduction du code génétique par le ribosome eucaryote. Pour cela, nous avons besoin de cristalliser et d’élucider les structures du ribosome eucaryote 80S entier avec ses principaux ligands fonctionnels, ARN messager (ARNm) et ARN de transfert (ARNt) naturels canoniques ou proches. Plus précisément, nous devons obtenir des cristaux du ribosome eucaryote 80S piégé dans les différents états du décodage, où le centre de décodage du ribosome eucaryote contiendra différentes paires de bases au niveau de l'hélice formée par le codon de l’ARNm et l’anticodon d’un ARNt canonique ou non portant toutefois toutes les modifications naturelles cruciales pour la précision du transfert de l'information génétique. Nous allons expliquer les bases moléculaires du mode d’action d'inhibiteurs tels que les aminoglycosides qui altèrent la précision de la traduction du ribosome eucaryote. Actuellement, nous sommes le seul groupe de recherche dans le monde travaillant sur la structure du ribosome eucaryote 80S entier (Saccharomyces cerevisiae) par analyse radiocristallographiques. Nous avons besoin de visualiser le chemin de l'ARN messager sur le ribosome eucaryote à l'échelle atomique et de décrire les interactions des ARNt naturels aux sites A, P et E avec les deux sous-unités.
Ces structures à haute résolution déterminées par radiocristallographie apporteront un premier aperçu structural au niveau atomique du mécanisme de fidélité de la traduction par les ribosomes eucaryotes. Ces nouvelles structures vont plus particulièrement faire apparaître les caractéristiques de l'appareil de traduction eucaryote qui sont essentielles pour le maintien du cadre de lecture de l'ARNm permettant d’obtenir une traduction efficace et précise de l'information génétique qui a été optimisées au cours de l'évolution.
Au cours de la phase d’élongation, le maintien du cadre de lecture de la synthèse protéique crucial pour la traduction précise de l'information génétique est possible par l'action du facteur d'élongation eEF2. L’interruption du cadre de lecture (déphasage) est catastrophique pour une cellule. Elle peut être provoquée soit par des mutations de la protéine eEF2 soit par une synthèse insuffisance résidu diphthamide, une histidine modifiée de eEF2 soit par un déséquilibre dans la machinerie de traductionnelle. Ainsi, notre autre objectif est de résoudre par radiocristallographie les structures du ribosome 80S de levure en complexe avec eEF2 dans l'état d'élongation canonique et dans un état représentant un événement de déphasage.
Nous allons également mener des études cristallographiques sur le mode d’action d'inhibiteurs du ribosome en utilisant les ribosomes procaryotes et eucaryotes comme modèles mais aussi des complexes du ribosome bactérien piégé dans différents états de décodage diffractant à haute résolution.