DS0401 - Etude des systèmes biologiques, de leur dynamique, des interactions et inter-conversions au niveau moléculaire

Bases moléculaires de l'entrée des rhabdovirus dans la cellule hôte – MoBaRhE

Comment les rhabdovirus entrent-ils dans les cellules qu'ils infectent ?

Les rhabdovirus, qui comptent parmi eux de nombreux virus mortels pour l'homme comme le virus de la rage, possèdent une glycoprotéine transmembranaire (G) qui est essentielle pour l’entrée du virus dans sa cellule hôte. Le projet vise à donc à comprendre comment cette clef virale ouvre les différentes serrures cellulaires.

Détermination des bases moléculaires de l'entrée des rhabdovirus dans la cellule hôte

L’objectif de ce projet est de caractériser les bases moléculaires de l’entrée des rhabdovirus dans la cellule hôte. Il comprend deux axes qui visent à : <br />1) Etudier l’interaction entre la glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire (VSV) et celle du virus de la rage (RAV) et leurs récepteurs identifiés (récepteur du LDL -LDLR- pour VSV, récepteur de basse affinité du facteur de croissance nerveuse -p75NTR- et molécule d’adhésion neurale -NCAM- pour RAV). <br />2) Elucider la façon dont G catalyse la fusion des membranes virale et cellulaire ; i.e. identifier les structures intermédiaires adoptées par G au cours de sa transition structurale fusogène et comprendre comment les glycoprotéines coopèrent entre elles à la surface du virus au cours du processus. <br />Plus précisément, nous souhaitons : <br />1) Déterminer la structure de l’ectodomaine de VSV G en complexe avec le module du LDLR qu’elle reconnait. <br />2) Déterminer la structure de l’ectodomaine de G d’autres rhabdovirus en particulier du virus de la rage. <br />3) Caractériser les structures intermédiaires prises par G durant la transition structurale.

Pour ce projet, nous utilisons plusieurs approches de biologie structurale :
1) Tout d'abord, nous cherchons à cristalliser les glycoprotéines de plusieurs rhabdovirus. Ceci implique que nous sommes capables de les exprimer en grande quantité. Pour cela, nous utilisons ou bien le virus lui-même, ou bien un système d'expression utilisant un autre virus : le baculovirus, qui permet l'expression de la glycoprotéine dans des cellules de lépidoptères. Une fois les cristaux obtenus, nous résolvons leur structure et donc celle de la glycoprotéine par diffraction des rayons X.
2) Ensuite, nous utilisons la microscopie électronique pour caractériser la structure et l'organisation supramoléculaire des glycoprotéines à la surface de la particule virale. Cela peut se faire après coloration de la particule à l'aide de sels lourds ou bien après congélation ultrarapide dans la glace amorphe.
3) Enfin, un des aspects originaux du projet consiste à utiliser la microscopie à force atomique à haute vitesse (HS-AFM) afin d’avoir accès à la dynamique de la transition structurale de G à la surface du virus dans des conditions très proches de son environnement naturel.

Nous venons de déterminer la structure de conformations intermédiaires de la glycoprotéine du virus de Chandipura (un autre vésiculovirus proche du VSV). Nous avons surtout validé les structures cristallographiques que nous avions déjà déterminées lors d’un projet ANR précédent. La structure cristalline présentait un arrangement dimérique inattendu. Nous avons construit une série de mutants portant des mutations à cet interface, vérifié que les propriétés de fusion étaient abolies et enfin sélectionné des mutations compensatrices.
Nous avons ensuite caractérisé finement l’interaction entre VSV G et son récepteur, le «Low density Lipoprotein Receptor« (LDLR). Le LDL R contient 7 domaines riches en cystéines (CR).Nous avons montré que G reconnait spécifiquement certains domaines CR du LDLR et nous avons pu déterminer la structure cristalline de G en complexe avec deux de ces domaines. Les deux structures ont révélé que les deux domaines CR se fixent de façon identique sur G. Les résidus engagés dans l'interaction entre G et chacun de ces deux domaines CR ont été identifiés.
Au cours de ce stravaux, nous avons démontré que les seuls récepteurs du virus sont tous de la famille du LDLR.
Ce travail résout définitivement le problème de la question des récepteurs du VSV : la glycoprotéine de ce virus évolué de façon à reconnaitre spécifiquement les domaines CR d’une famille de récepteurs cellulaires. Cela ouvre d’intéressantes perspectives pour une protéine et un virus extrêmement utilisés en biotechnologies.

Nous sommes en train d'exprimer plusieurs autres glycoprotéines de rhabdovirus. Notre objectif est toujours d'en déterminer la structure afin d'avoir une vision globale de leur fonctionnement mais aussi des contraintes qui pèsent sur leur évolution.
La détermination de la structure de la G du VSV en complexe avec son récepteur ouvre d'intéressantes perspectives en biotechnologie. Elle constitue en effet une première étape pour la construction de mutants reconnaissant d’autres récepteurs spécifiques.

1) Baquero E, Albertini AA, Raux H, Abou-Hamdan A, Boeri-Erba E, Ouldali M, Buonocore L, Rose JK, Lepault J, Bressanelli S, Gaudin Y. Structural intermediates in the fusion-associated transition of vesiculovirus glycoprotein. EMBO J. 2017 36(5):679-692.

Les rhabdovirus sont des virus enveloppés dont le génome est un ARN simple brin de polarité négative. Les rhabdovirus les plus étudiés sont le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) et le virus de la rage (RAV) qui est responsable de 50000 décès annuels. D’autres rhabdovirus (tel le virus Chandipura, CHAV) sont mortels pour l’homme ou susceptibles de causer d’importants dommages économiques.
Les rhabdovirus possèdent une glycoprotéine transmembranaire G qui est essentielle pour l’entrée virale. Tout d’abord, G reconnait un récepteur à la surface de la cellule. Ensuite, après endocytose du virion, dans l’environnement acide de l’endosome, G subit une transition structurale de grande amplitude. Cette transition favorable d’un état pré-fusion vers un état post-fusion catalyse la fusion des membranes virale et endosomale. Durant ce changement de conformation, G expose des motifs hydrophobes qui vont s’ancrer dans la membrane cible et la déstabiliser.
G est le prototype des glycoprotéines de fusion de classe III qui contient aussi les glycoprotéines gB des herpesvirus et gp64 du baculovirus. Parmi toutes les structures déterminées de protéines de cette classe, on ne trouve qu’une seule structure pré-fusion, celle de VSV G.
Ce projet regroupe 3 équipes, une de biochimistes et de virologues spécialistes des rhabdovirus, une de microscopistes électroniques et une experte en microscopie à force atomique (AFM). Son objectif est de caractériser les bases moléculaires de l’entrée des rhabdovirus dans la cellule hôte. Il comprend deux axes qui visent à :
1) Etudier l’interaction entre VSV et RAV G et leurs récepteurs identifiés (récepteur du LDL -LDLR- pour VSV, récepteur de basse affinité du facteur de croissance nerveuse -p75NTR- et molécule d’adhésion neurale -NCAM- pour RAV).
2) Elucider la façon dont G catalyse la fusion ; i.e. identifier les structures intermédiaires adoptées par G au cours de la transition structurale et comprendre comment les glycoprotéines coopèrent entre elles à la surface du virus au cours du processus. Ces questions se posent pour toutes les glycoprotéines virales de fusion au-delà de celle des rhabdovirus.
Plus précisément, nous souhaitons :
1) Déterminer la structure de l’ectodomaine de VSV G en complexe avec le module du LDLR qu’elle reconnait.
2) Déterminer la structure de l’ectodomaine de G d’autres rhabdovirus. Nous travaillerons sur les ectodomaines des deux glycoprotéines, structurale et non structurale, du virus de la fièvre éphémérale bovine (qui sont homologues mais dont l’une a perdu ses propriétés de fusion) et sur celui de RAV G. Ces ectodomaines seront cristallisés seuls ou, dans le cas de RAV G, en complexe avec des formes solubles des récepteurs cellulaires.
3) Caractériser les structures intermédiaires prises par G durant la transition structurale.
Simultanément, la structure de G dans son environnement naturel (à la surface de la particule virale) sera aussi étudiée par microscopie électronique (ME) et microscopie à force atomique à haute vitesse (HS-AFM). Avec la ME, nous espérons visualiser des intermédiaires de fusion que nous savons piéger in vitro. Avec l’HS-AFM, nous espérons avoir accès à la dynamique de la transition structurale de G et de sa réorganisation en réseau.
Enfin, la construction de mutants et la caractérisation de leurs propriétés permettront de valider les hypothèses issues de l’analyse structurale.
Bien que ce projet collaboratif relève essentiellement de la recherche fondamentale, il contient plusieurs aspects qui pourraient avoir un impact dans le domaine médical comme, par exemple, l’élaboration de nouvelles molécules antivirales ou encore celle d’un nouveau vaccin à large spectre contre les virus apparentés au RAV.

Coordinateur du projet

Monsieur Yves GAUDIN (Institut de Biologie Cellulaire Intégrative)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

UMR9198 CEA/CNRS/PSUD Institut de Biologie Cellulaire Intégrative
U1006 INSERM Bio Atomic Force Microscopy Laboratory
UMR9198 CEA/CNRS/PSUD Institut de Biologie Cellulaire Intégrative

Aide de l'ANR 490 990 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2015 - 36 Mois

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