DS0401 - Etude des systèmes biologiques, de leur dynamique, des interactions et inter-conversions au niveau moléculaire

La maturation de l'ARN ribosomique et son lien avec le contrôle de qualité de l'assemblage du ribosome – ARNr-QC

Lien entre la maturation des ARNr et l'assemblage du ribosome

Nous avons identifié de multiples liens entre la maturation des ARNt, l’assemblage du ribosome et le processing des ARNr. Ce projet vise à comprendre ces liens mécanistiques de façon détaillée.

Etudier le processing des ARNr 16S, 23S et 5S et sa relation avec le processus d'assemblage du ribosome et la maturation des ARNt.

Les ribosomes, ces grands complexes ribonucléo-protéiques impliqués dans la synthèse protéique, sont essentiels à la vie. Dans les cellules qui se divisent rapidement, leur biosynthèse représente la majeure partie de l’activité transcriptionnelle et de la consommation en énergie de la cellule. Les erreurs dans le processus d’assemblage des ribosomes ne sont de ce fait pas tolérées et les cellules possèdent des mécanismes de surveillance actifs induisant la dégradation des ribosomes mal assemblés. Des mutations augmentant les défauts d’assemblage chez l’homme sont associées à des ‘ribosomopathies’, dont le cancer soulignant l’importance de l’exactitude de l’assemblage des ribosomes et la liaison de ce processus avec d’autres activités cellulaires, telles que la division cellulaire. Au début de ce projet, notre laboratoire avait découvert un lien entre défaut de maturation en 5’ des ARN de transfert et défaut d’assemblage de la petite sous-unité (30S) du ribosome chez la bactérie modèle à Gram-positif, Bacillus subtilis. Ce contrôle-qualité permettrait l’arrêt de la biogenèse des ribosomes en cas de production anormale des ARNt. Nous proposons de caractériser ce contrôle-qualité et de déterminer dans quelle mesure il affecte la maturation de l’extrémité 3’ de l’ARNr 16S. L’enzyme resposanble de cette dernière étape majeure de maturation de l’ARNr reste inconnue chez B. subtilis; un des volets de ce projet consiste à identifier cette RNase. Nous cherchons également à approfondir notre compréhension des étapes de contrôle-qualité impliquées dans la maturation des ARNr 23S et 5S de la grande sous-unité (50S) du ribosome en étudiant, au niveau moléculaire, le rôle de protéines ribosomiques. Si le contrôle-qualité de l'assemblage des ribosomes a été assez bien étudié chez la levure, cette question n’a jamais été abordée en détail chez les bactéries. Nous espérons que ce projet augmentera de façon significative notre compréhension de ces mécanismes de contrôle-qualité.

Tâche 1. Nos études des complexes de maturation des ARNr 5S et 23S seront réalisées en utilisant des approches standard de la biologie structurale (cristallographie, RMN et SAXS). Les composants protéiques des complexes seront purifiées chez E. coli, les composants ARN par transcription in vitro. Les complexes seront assemblés en incubant les composants ensemble suivi d’une purification sur colonne de gel filtration pour des essais de cristallogenèse et collecte de données SAXS etc. Tâche 2. Les substrats ARN messager de la RNase P codant pour des facteurs qui pourraient avoir un impact sur l'assemblage du ribosome seront identifiés au niveau global par des expériences de séquençage de l'ARN ainsi que par Northern blots sondés pour des ARNm codant pour les protéines d'assemblage connues. Une fois des substrats potentiels identifés, nous cartographierons les sites de clivage in vivo et in vitro, et nous déterminerons les mécanismes de régulation impliqués par des approches standard de biologie moléculaire et génétique. Tâche 3. Nous avons initialement proposé d'utiliser plusieurs techniques (cross-link, purification etc) afin d'identifier l'enzyme impliquée dans la maturation de l'ARN 16S. Maintentant que nous pensons l'avoir identifiée, nous essayerons de determiner l'intermédiaire exacte d'assemblage qui serait le substrat pour cette enzyme en isolant des ribosomes bloqués à certains stades d'assemblage (en utilisant des mutants d'assemblage) et puis en ajoutant l'enzyme purifiée in vitro afin de tester si la maturation a lieu.

1. Identification des conditions préliminaires de cristallisation et l'obtention des données SAXS pour le complexe 5S/L18/RNase M5
2. Identification d'un substrat potentiel de la RNase P qui pourrait expliquer le défaut d'assemblage de la sous-unité 30S dans des cellules déplétées de cette enzyme
3. Identification d'un candidat pour la maturation 3' de l'ARNr 16S

Nous avons identifié des conditions préliminaires de cristallisation du complexe 5SARNr/L18/M5 qui sont en cours d’optimisation. Nous allons bientôt commencer des expériences qui ont pour but l'identification du fragment minimal de l'ARNr 23S nécessaire au clivage par la Mini-III afin de débuter les études structurales sur ce complexe associé au co-facteur L3. Nous avons identifié un substrat potentiel de la RNase P qui pourrait expliquer le defaut d'assemblage de la sous-unité 30S. Nos futures expériences auront comme but de confirmer cet effet, de confirmer si il est direct et, si oui, de cartographier le site de clivage afin de comprendre le mécanisme. Enfin, nous pensons avoir identifié l'enzyme responsable de la maturation de l'extrémité 3' de l'ARNr 16S. Nos futures exprériences se focaliseront sur la détermination des co-facteurs impliqués.

Rae1/YacP, a new endoribonuclease involved in ribosome-dependent mRNA decay in B. subtilis. EMBO J. In press

Characterisation of the quality control link between tRNA processing and ribosome assembly in Bacillus subtilis. 3rd course in Post-t

Les ribosomes, ces grands complexes ribonucléo-protéiques impliqués dans la synthèse protéique, sont essentiels à la vie. Au sein des cellules qui se divisent rapidement, la biosynthèse des ribosomes représente la plupart de la transcription et consomme la majeure partie de l’énergie cellulaire. Les erreurs dans le processus d’assemblage des ribosomes ne sont donc pas tolérées et les cellules possèdent des mécanismes de surveillance actifs qui permettent la dégradation des ribosomes mal assemblés afin d’éviter la fabrication de protéines aberrantes. Des mutations qui augmentent les défauts d’assemblage chez l’homme sont associées à de nombreuses ‘ribosomopathies’, dont le cancer, ce qui souligne l’importance de l’exactitude de l’assemblage des ribosomes pour le bien-être de la cellule et la liaison intrinsèque de ce processus avec d’autres activités de la cellule, telles que la division cellulaire. Notre laboratoire a récemment découvert un lien de cause à effet entre la un défaut de maturation en 5’ des ARN de transfert et un défaut de l’assemblage de la petite sous-unité (30S) du ribosome chez la bactérie modèle à Gram-positif, Bacillus subtilis. La fonction de ce contrôle qualité serait de pouvoir arrêter la biogénèse des ribosomes si la production des ARNt est anormale. Nous nous proposons de caractériser ce contrôle qualité et de déterminer dans quelle mesure il affecte la maturation de l’extrémité 3’ de l’ARNr 16S. Cette dernière réaction est la seule étape majeure de maturation de l’ARNr pour laquelle l’enzyme reste inconnue chez B. subtilis; un des pans de ce projet consiste à identifier cette enzyme. Nous cherchons également à approfondir notre compréhension des étapes soupçonnées de contrôle qualité impliquées dans la maturation de l’assemblage des ARNr de la grande sous-unité (50S) du ribosome en étudiant, au niveau moléculaire, les rôles de protéines ribosomiques spécifiques dans la maturation des ARNr 23S et 5S. Si le contrôle qualité de l'assemblage des ribosomes a été assez bien étudié chez la levure, cette question n’a jamais été abordée en détail chez les bactéries. Ce projet aura donc un impact important pour la compréhension générale du phénomène et pour des applications en médecine en termes de nouvelles cibles potentielles d'antibiotiques chez les bactéries proches.

Coordinateur du projet

Monsieur Condon Ciaran (Expression Génétique Microbienne)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CNRS FRE3630 Expression Génétique Microbienne
LCRB Laboratoire de Cristallographie et RMN biologiques
EXPRESSION GENETIQUE MICROBIENNE
DMVM Department of Molecular Virology and Microbiology

Aide de l'ANR 496 000 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2015 - 48 Mois

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