DS0504 - Enjeux de santé

Approches à différentes échelles pour caractériser les interactions cellulaires, le transfert trophique et les impacts toxiques de nanoparticules métalliques chez les organismes aquatiques – CITTOXIC-Nano

Les organismes aquatiques face aux nanoparticules métalliques

Suite au développement croissant des nanotechnologies, les nanoparticules métalliques (NP) rejetées dans l’environnement peuvent interagir avec les organismes aquatiques. La question est de comprendre comment ces NP rentrent dans les cellules, quels sont les impacts toxiques générés, si les NP sont transférées le long des chaines trophiques et quelle est la contribution des produits domestiques dans leur rejet ?

Caractérisation à différentes échelles de l’impact des nanoparticules métalliques

L’utilisation croissante des nanomatériaux depuis une vingtaine d’année en raison de leurs propriétés remarquables à la taille nanométrique a conduit à leur dispersion croissante dans l’environnement. L’or et l’argent font partie des métaux les plus utilisés notamment pour des applications biomédicales ou en tant que biocide, mais peuvent également se retrouver dans des produits de consommation courante à usage domestique. Leur production, transport et utilisation peut conduire à leur rejet dans les systèmes aquatiques. Dans ces milieux, les nanoparticules d’or ou d’argent (AuNP et AgNP) peuvent interagir avec les organismes vivants, être transférées le long des réseaux trophiques et potentiellement générer des effets toxiques.<br />L’objectif est ainsi de caractériser les mécanismes d’internalisation, d’impact toxique et de transfert trophique des AuNP et AgNP chez plusieurs espèces clés des réseaux trophiques aquatiques (diatomées du biofilm, bivalves filtreurs, poissons racleurs et poissons carnivores). L’originalité du projet réside dans la mise en oeuvre de différentes techniques complémentaires développées à plusieurs échelles (moléculaire, cellulaire, organismes, réseau trophique) de manière à caractériser ces mécanismes et proposer des outils pertinents d’évaluation de l’impact des nanomatériaux dans les systèmes aquatiques. L’estimation des rejets issus de l’utilisation de produits domestiques à usage courant contenant des NP nous permettra également d’aborder la réelle exposition des organismes en milieu naturel.

Les mécanismes d’internalisation et de toxicité des NP sont abordés in vitro par l’utilisation de cultures primaires de cellules d’artères pulmonaires humaines pour lesquelles des inhibiteurs de différentes voies d’endocytose sont connus. Ces méthodes sont transposées à des cultures primaires d’hémocytes de bivalves et à des lignées cellulaires de foie de poissons pour lesquelles ces outils sont encore très peu développés. In vivo, les impacts toxiques sont étudiés à l’échelle moléculaire par la mesure du niveau d’expression de plusieurs gènes d’intérêt qui ont au préalable été caractérisés chez les espèces cibles (diatomées) ou utilisant la technologie récente du séquençage haut débit du transcriptome (bivalves, poissons). Ces nouvelles technologies permettent de caractériser les réponses précoces des organismes même à très faible dose d’exposition, n’entrainant pas forcément de bioaccumulation dans les tissus, et révélant ainsi les potentiels effets générés en milieu naturel. Le transfert et les impacts associés aux NP sont également étudiés le long de leur transit dans des chaines trophiques simplifiées à deux et trois maillons, respectant des conditions naturelles d’exposition. Ces études sont complétées par de l’imagerie in vivo permettant, grâce à la synthèse de NP fluorescentes, de localiser le trajet des NP lors d’une exposition par la voie directe (eau) ou par la voie trophique (nourriture) sur animal vivant. Enfin, des enquêtes menées auprès des ménages permettent d’identifier les produits domestiques à usage courant susceptibles d’être source de rejets dans les milieux aquatiques

Les principaux résultats obtenus in vitro montrent une influence de la taille et de la charge des NP sur les effets toxiques engendrés, mais ceux-ci diffèrent d’un type cellulaire à l’autre. Les AgNP se révèlent être plus toxiques que les AuNP. Pour les diatomées, une sensibilité particulière de certaines espèces a été constatée face aux NP, avec une induction de gènes impliqués dans la lutte contre le stress oxydant, malgré une absence de bioaccumulation. Grâce à une collaboration mise en place avec l’USGS de Californie, des expérimentations de modélisation biodynamique ont pu être développées. Celles-ci ont mis en évidence que les bivalves accumulent 2 à 10 fois plus l'Ag que l'Au sous forme NP et jusqu'à 100 fois plus sous sa forme ionique. Par contre, les AuNP génèrent plus d’impacts au niveau génétique que les AgNP, malgré leur faible accumulation. Concernant le modèle poisson, le taux de transfert trophique des AuNP à partir d’une nourriture artificiellement enrichie s’est révélé extrêmement faible. Cependant, malgré l’absence d’accumulation de NP dans les anguilles, des impacts ont été mis en évidence par séquençage haut-débit du transcriptome du foie et du cerveau. Les gènes différentiellement exprimés (respectivement 258 et 156) sont impliqués dans la réponse à un stimulus, la mort cellulaire mais surtout dans le système immunitaire et l’inflammasome. Une expérience plus récente à l’aide de nourriture « naturellement contaminée » a mis en évidence un transfert trophique significatif d’Au chez les anguilles, mettant en évidence l’importance des processus biologiques dans la biodisponibilité et le transfert des NP. Enfin, des expérimentations de relargage d’Ag suite au lavage de chaussettes de sport contenant des AgNPs ont pu mettre en évidence le risque de dispersion de ces nanomatériaux vers le milieu aquatique.

Les résultats obtenus jusqu’à présent vont être confrontés à ceux obtenus après exposition à des nanoparticules manufacturées de manière à observer si les outils développés dans ce travail pourront être généralisables aux NP métalliques dans leur ensemble. De plus, l’impact de NP fluorescentes couramment utilisées dans les approches de toxicité, comparativement aux NP de même nature sans fluorochrome permettront de préciser si celles-ci induisent des effets toxiques plus importants que des NP non fluorescentes. Enfin, l’estimation des rejets de NP issus des produits courants à usage domestique permettra de mettre en regard nos résultats avec les expositions réelles des organismes en milieu naturel

Les premiers résultats de ce projet ont permis de publier deux articles dans ESPR sur les mécanismes d’interactions des AgNP avec les biofilms diatomiques. Deux autres articles sont parus dans ESPR sur la synthèse d’AuNP par les diatomées et la capacité de transfert et les impacts toxiques des AuNP lors de chaines trophiques expérimentales à deux maillons. Un cinquième article est actuellement soumis dans ETC. Plusieurs communications lors de congrès internationaux (SETAC, SEFA, EMC, ICEENN, SCPB, …) ont déjà été données (2 oraux et 6 posters)

Ce projet interdisciplinaire a pour but d'étudier pour la première fois le comportement, la capacité d’interaction, l'internalisation, l'impact toxique et le transfert trophique de nanoparticules métalliques (NPs), considérées comme modèles de NPs potentiellement rencontrées dans les écosystèmes naturels. En plus de leur large utilisation en milieu biomédical et industriel, leurs propriétés physiques et chimiques spécifiques leurs confèrent des atouts permettant leur traçabilité au cours d’expériences de laboratoire pour évaluer la nature de leurs interactions et les possibles impacts toxiques engendrés dans les différents compartiments biologiques, mais aussi pour prédire les conséquences environnementales le long des réseaux trophiques d’eau douce. Différentes stratégies sont ainsi proposées à plusieurs niveaux d'organisation (moléculaire, cellulaire, organisme et chaîne trophique) pour étudier l'impact biologique de NPs d'or (Au) et d'argent (Ag) chez les organismes d'eau douce (diatomées périphytiques, mollusques bivalves et poissons). La synthèse et la caractérisation de NPs de taille, forme, enrobage et charge différentes seront particulièrement adaptées pour envisager les différentes expériences proposées. De nouvelles cibles moléculaires du transcriptome seront recherchées, notamment chez les diatomées et bivalves pour étendre nos possibilités de compréhension des mécanismes d'action des NPs chez les organismes aquatiques. Les interactions des NPs avec des différents types cellulaires (diatomées, hémocytes de bivalve et hépatocytes d'anguille) seront étudiées pour quantifier les groupes fonctionnels impliqués dans la fixation NPs et aussi caractériser les mécanismes d'internalisation de ces particules par les cellules en culture. Au niveau de l'organisme, la bioaccumulation des NPs sera quantifiée par l'analyse des métaux dans les organes et la localisation tissulaire et intracellulaire des particules sera déterminée par microscopie corrélative (optique, confocale, de fluorescence et électronique à transmission) et par des techniques d'image en radiographie 2D et 3D. Les impacts toxiques produits par ces NPs seront aussi évalués par des analyses histologiques, la quantification de protéines impliquées dans la détoxication des métaux et l’analyse quantitative d'expression de gènes impliqués dans différentes fonctions (stress oxydatif, détoxication, métabolisme mitochondrial, apoptose, génotoxicité). Le transfert trophique de NPs métalliques entre diatomées periphytiques et poissons sera ensuite étudié, avec deux à trois niveaux de transfert trophique. Le consommateur final de cette chaîne sera l'anguille européenne Anguilla anguilla pour laquelle l'ingestion in vivo d'AuNPs marquées par une sonde fluorescente sera étudiée par imagerie de fluorescence et les impacts toxiques par l'utilisation d'une puce à ADN. La construction de cette puce à ADN comprenant 1000 gènes a été menée dans notre laboratoire dans le cadre du projet d’ANR Internationale IMMORTEEL France/Québec. Elle permettra de caractériser spécifiquement la modulation d’expression de gènes après exposition aux NPs et de définir précisément les mécanismes de toxicité impliqués chez le poisson. Enfin, en raison de l'incorporation de NPs dans des produits de consommation, et les sources domestiques représentant une dispersion significative de NPs dans les écosystèmes, l'approche d'écologie humaine, surtout l'approche d'écologie familiale, aura pour but d'identifier les produits de consommation concernés, de clarifier leur utilisation et d’évaluer les productions de NPs, pour relier l'utilisation de produits de consommation aux impacts écotoxicologiques des écosystèmes aquatiques. Toutes ces approches nous aideront à réaliser un diagnostic complet des impacts qui pourraient être attendus chez les organismes aquatiques et le long des réseaux trophiques après une contamination par Au ou AgNPs.

Coordinateur du projet

Madame Magalie BAUDRIMONT (Environnements et Paléoenvironnements Océaniques et Continentaux)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

ADESS Aménagement, Développement, Environnement, Santé et Société
CEREGE Centre Européen de Recherche et d'Enseignement des Géosciences de l'Environnement
GET Géosciences Environnement Toulouse
ICMCB Institut de Chimie de la Matière Condensée de Bordeaux
EPOC Environnements et Paléoenvironnements Océaniques et Continentaux

Aide de l'ANR 440 000 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2014 - 48 Mois

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