Mécanismes moléculaires d'une nouvelle fonction du Médiateur liant la transcription et la réparation de l'ADN chez les eucaryotes – MEDinREPAIR

Ce projet vise à étudier l'interaction fonctionnelle entre deux processus essentiels et extrêmement complexes liés à la chromatine et fournira des informations importantes sur la coordination de ces processus biologiques fondamentaux. Nous explorons ce lien en utilisant la levure et les cellules humaines comme nos modèles biologiques, en adressant la question de la conservation des mécanismes chez les eucaryotes, et en appliquant des approches intégratives qui incluent la biologie moléculaire, la génétique, la biochimie, la génomique fonctionnelle et la bioinformatique. Nous déterminons l'interface d'interaction entre le Médiateur et la machinerie de la réparation de l'ADN. Pour étudier la relation fonctionnelle entre le Médiateur et la réparation de l'ADN, nous utilisons notre grande collection de mutants du Médiateur. Nous développons aussi des analyses avancées à l’échelle du génome.

Durant la première période de réalisation du projet, nous avons déterminé les domaines d’interaction entre le Médiateur et la protéine Rad2, un résultat important qui va nous permettre de transposer notre étude au modèle cellules humaines. Nous avons pu montrer que l’interaction physique entre le Médiateur et la protéine XPG, homologue humain de Rad2, existe dans les cellules HeLa non-modifiées et aussi dans les fibroblastes primaires. De plus, nous avons identifié de nouveaux liens du Médiateur avec la machinerie de réparation de l’ADN en montrant des interactions physiques entre ce complexe et plusieurs protéines de la NER. Nous avons obtenu la preuve de principe et les premiers résultats qui nous permettront de développer de nouvelles approches génomiques et de les appliquer à notre étude.

Ce projet est une étude fondamentale qui nous permettra de construire une vision intégrée des fonctions du Médiateur dans les processus nucléaires ouvrant des perspectives intéressantes pour les études du Médiateur et, plus généralement, élargissant nos connaissances sur les mécanismes moléculaires qui relient la transcription avec d'autres transactions chromatiniennes comme la réparation de l'ADN. Nous proposons que le Médiateur puisse servir de plate-forme d'assemblage ou d'un élément de régulation reliant la transcription avec la réparation de l'ADN. Considérant la conservation du Médiateur et des facteurs de la réparation de l'ADN dans l'évolution, les mécanismes moléculaires que nous allons déchiffrer grâce à la puissance de la levure S. cerevisiae comme notre modèle principal sont susceptibles d'être pertinents pour tous les eucaryotes, y compris l'homme. En outre, nous abordons directement cette question dans les cellules humaines, y compris des lignées cellulaires dérivées de patients XPG. Nous pensons que cette étude de la conservation des fonctions du Médiateur pourrait révéler des complications intéressantes dans les cellules humaines et donc aider dans notre compréhension des maladies humaines. Compte tenu (i) le rôle crucial de la transcription et de la réparation de l'ADN dans la vie, (ii) l'importance capitale de l'interaction fonctionnelle entre ces processus essentiels, (iii) la conservation du Médiateur et Rad2/XPG chez les eucaryotes et (iv) l'implication du Médiateur et de la protéine XPG dans les maladies humaines, nous pensons que ce projet porte sur des questions clés et va avoir un impact important sur la communauté scientifique.

Eyboulet F., Wydau-Dematteis S., Eychenne T., Alibert O., Neil H., Boschiero C., Nevers M.-C., Volland H., Cornu D., Redeker V., Werner M., & Soutourina J. (2015) Mediator independently orchestrates multiple steps of preinitiation complex assembly in vivo. Nucleic Acids Research, 43(19), 9214-9231

Eychenne T., Novikova E., Barrault M.-B., Alibert O., Boschiero C., Peixeiro N., Cornu D., Redeker V., Kuras L., Nicolas P., Werner M. & Soutourina J., Functional interplay between Mediator and TFIIB in preinitiation complex assembly in relation to promoter architecture (submitted).

Le Médiateur de la régulation transcriptionnelle est un grand complexe multiprotéique (1,5 MDa), conservé dans tous les eucaryotes. Il joue un rôle crucial dans l’activation de la transcription par l’ARN polymérase II (Pol II). Chez l’homme, les mutations du Médiateur provoquent des pathologies graves. Depuis plusieurs années, nous nous intéressons aux mécanismes moléculaires de la fonction du Médiateur en utilisant des approches de la biologie intégrative. Nous avons établi un rôle du Médiateur dans le recrutement de la Pol II et du facteur général de la transcription TFIIH.
La transcription est couplée à la réparation de l’ADN afin d’assurer la continuité de la progression de la Pol II. Les dommages à l’ADN peuvent conduire à des problèmes du développement, de la croissance cellulaire et de la survie. Des composants de la machinerie de la transcription ou de la réparation de l’ADN peuvent participer aux deux processus. La réparation de l’ADN par excision des nucléotides (NER) est une voie majeure de la réparation de l’ADN nécessaire à la réparation des dimères cyclobutaniques de pyrimidines (CPD), les lésions induites par les UVs. La voie de la réparation du génome global opère sur l’ensemble des séquences génomiques et la réparation couplée à la transcription répare les dommages à l’ADN qui interfèrent avec la progression de la Pol II. La réaction NER et les composants requis pour la reconnaissance efficace des lésions d’ADN et leur réparation sont bien connus in vitro. Cependant, la coordination active entre la transcription et la réparation de l’ADN in vivo, notamment au niveau génomique, reste encore à étudier.
Récemment, nous avons découvert que, chez la levure, le complexe Médiateur joue un rôle important liant la transcription et la réparation de l’ADN via un contact direct avec Rad2, l’homologue de la protéine XPG humaine. Des mutations dans le gène XPG humain provoquent une maladie génétique, xeroderma pigmentosum (XP), associée au syndrome de Cockayne (CS). Nos résultats suggèrent que le Médiateur est impliqué dans la réparation couplée à la transcription en facilitant le recrutement de Rad2 sur les gènes transcrits. Nous proposons une hypothèse excitante selon laquelle le Médiateur, en plus de sa fonction fondamentale coactivatrice, agit également au delà de la transcription.
Ce projet vise à décrypter comment le Médiateur recrute les composants de la machinerie de la réparation de l’ADN et stimule la réparation des gènes activement transcrits et à disséquer les mécanismes moléculaires impliqués.
L’originalité et la nouveauté du projet résident (i) dans le développement des nouveaux concepts de la fonction du Médiateur chez les eucaryotes, (ii) dans la nécessité d’aborder la question cruciale d’un lien fonctionnel entre la transcription et la réparation de l’ADN in vivo, (iii) dans l’intégration des approches avancées de la génomique fonctionnelle, de photo-pontage in vivo, de la biologie moléculaire, la biochimie, la bioinformatique, la génétique de la levure et la biologie des cellules humaines, (iv) dans de nouvelles perspectives pour notre compréhension des graves pathologies humaines.
Nous allons déterminer l’interface d’interaction entre le Médiateur et la machinerie de réparation de l’ADN. Notre large collection des mutants du Médiateur va nous permettre d’étudier l’importance physiologique de ce lien. La conservation des mécanismes va être étudiée dans les cellules humaines. Des nouvelles approches génomiques vont nous permettre de définir la dynamique d’association du Médiateur et de la protéine Rad2/XPG, ainsi que la distribution des dommages à l’ADN après une exposition aux UVs. Nous allons déterminer si les fonctions des autres facteurs NER et du Médiateur sont liées.
En conclusion, nous allons développer des nouveaux concepts de la coordination entre la transcription et la réparation de l’ADN in vivo, deux processus fondamentaux dont le dysfonctionnement conduit à de graves pathologies humaines.