Procédés innovants pour la culture semi-industrielle de cellules souches mésenchymateuses humaines – STEMCellREAcTOR

L'objectif est d’abord d'élaborer les outils de simulation numérique permettant une description Euler-Lagrange de l'écoulement solide-liquide. Les grandeurs Eulériennes de l'écoulement au sein de minibioréacteurs seront obtenues via des simulations CFD-RANS et validées expérimentalement. Une description plus poussée de la turbulence sera menée par des simulations LES pour les conditions les plus prometteuses. La dynamique des particules sera étudiée numériquement et expérimentalement établissant, pour les microporteurs, leurs gradients de concentration, leurs probabilités de collision et leurs trajectoires afin d'accéder aux historiques de conditions hydrodynamiques particulaires. Un travail spécifique dédié à la conception et à la synthèse de microporteurs et de microcapsules fonctionnalisées « à façon » sera mené pour répondre aux besoins physiologiques des CSMh en mimant leurs niches organiques naturelles et pour espérer, à terme, une augmentation sensible des performances de production de cellules. Sur la base des premiers résultats obtenus, des configurations de mélange, d’aération et de matériaux utilisés pour l’adhérence cellulaire seront retenues. Pour celles-ci, des cultures de CSMh seront réalisées en minibioréacteurs agités. L’ensemble des résultats obtenus seront analysés pour modéliser les couplages entre la réponse cellulaire et le microenvironnement cellulaire. Ce modèle hydro-biologique servira de base à la proposition de règles d’extrapolation et de conduite d’un procédé de culture à plus grande échelle. Enfin, la conception du bioréacteur pilote devra répondre non seulement aux contraintes imposées par le modèle hydro-biologique mais également à celles d’un cahier des charges intégrant des critères règlementaires, de choix de matériau et de (éco)conception intégrée facilitant l’utilisation du bioréacteur, notamment en milieu hospitalier. Ce système sera validé numériquement et expérimentalement par la mise en oeuvre de culture de CSMh.

Tâche 1
Mise en place d’un système expérimental de mesure de la concentration locale en microporteurs au sein de cuve agitée par mesure de l’intensité de la transmission de la lumière.
Simulation numérique des écoulements liquide-µP au sein de cuves agitées.

Tâche 2
Mise en œuvre de microporteurs à cœur PLA et couronne dextrane qui seront sans doute les premiers microporteurs totalement biodégradables. L'importance du lien covalent entre le cœur et la couronne a été mise en évidence pour des nanoparticules sur le plan de leur stabilité colloïdale dans le milieu de culture des cellules souches ou vis-à-vis d'un tensioactif compétitif puissant. Enfin, les tous premiers microporteurs photo-sensibles (totalement innovants selon la bibliographie) ont été élaborés.

Tâche 3. La culture des cellules souches mésenchymateuses issues de moelle osseuse (BM-CSM) a été réalisée sur les microporteurs à base de PLA, synthétisés précédemment dans le cadre de la sous-tâche 2.1. Les résultats préliminaires ont montré que les cellules présentaient un faible taux d’adhérence du fait probablement du caractère hydrophile et neutre de la surface des microporteurs. Ainsi, des tests sur support 2D sont actuellement en cours pour valider la formulation des surfaces. Par ailleurs, un travail bibliographique a été réalisé afin de déterminer la composition optimale du milieu de culture pour l’expansion de cellules souches mésenchymateuses issues de cordons ombilicaux (UC-CSM). Un milieu de culture dédié et répondant à la règlementation des Bonnes Pratiques de Fabrication a été identifié et repose sur l’utilisation de lysat plaquettaire humain de grade clinique. Les premières cultures de ces cellules en bioréacteur seront réalisées en employant ce milieu de culture spécifique, comme prévu, en automne 2016

Revues à comité de lecture
Collignon, M. L., Delafosse, A., Calvo, S., Martin, C., Marc, A., Toye, D., & Olmos, E. (2016). Large-Eddy Simulations of microcarrier exposure to potentially damaging eddies inside mini-bioreactors. Biochemical Engineering Journal, 108, 30-43.
Martin, C., Olmos, É., Collignon, M. L., De Isla, N., Blanchard, F., Chevalot, I., ... & Guedon, E. (2016). Revisiting MSC expansion from critical quality attributes to critical culture process parameters. ProcessBiochemistry. In press..
Aljawish, A; Muniglia, L; Chevalot, I (2016) Growth of human mesenchymal stem cells (MSCs) on films of enzymatically modified chitosan Biotechnology Progress, 2016, 32 (2), 491-500.
Olmos, E., Loubiere, K., Martin, C., Delaplace, G., & Marc, A. (2015). Critical agitation for microcarrier suspension in orbital shaken bioreactors: Experimental study and dimensional analysis. Chemical Engineering Science, 122, 545-554.
Laurent, C.P.; Vaquette, C.; Martin, C.; Guedon, E.; Wu, X.; Delconte, A.; Dumas, D.; Hupont, S.; Isla, N.D.; Rahouadj, R.; Wang, X(2014). Towards a Tissue-Engineered Ligament: Design and Preliminary Evaluation of a Dedicated Multi-Chamber Tension-Torsion Bioreactor. Processes, 2, 167–179
Communications /diffusion
Martin C., Piccini A., Chevalot I., Olmos E., Guedon E., Marc A., (2015). Serum-free media for Mesenchymal Stem Cells expansion on microcarriers. 24th ESACT meeting «Cells, Culture, Patients, Products«, 31 mai-3 juin 2015, Barcelone. BMC Proceedings, 9 (Suppl 9): P70.
Olmos, E. (2016). Analyse dimensionnelle de la mise en suspension de particules en fioles agitées sur table orbitale. Journée thématique de la Société Française de Génie des Pro-
cédés, Paris, 8 mars 2016.
A.Roy, J. Babin, M. Leonard, A. Durand, J.-L. Six, «Microporteurs biodégradables pour la culture de cellules souches mésenchymateuses humaines en bioréacteur« ,14e Journée Scientifique du GFP section Grand-Est, Nancy, 16 juin 2016.

Les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) permettent d’envisager des applications très prometteuses, notamment en médecine régénérative. Ces cellules présentant de fortes spécificités (capacités de croissance limitées dans le temps, capacités de différenciation cellulaire reliées à leur microenvironnement biochimique et hydromécanique), l’utilisation de ces cellules-produits à grande échelle présente encore un certain nombre de limitations telles que l’obtention d’un procédé d’expansion cellulaire robuste (qualité et quantité des cellules produites). Partant du constat que les bioréacteurs disponibles pour la culture de cellules souches sont soit des systèmes directement transposés de la culture de lignées cellulaires continues, soit des systèmes non ou mal « contrôlés », le projet STEMCREATOR propose, dans un premier temps, le développement d’une méthodologie scientifique rigoureuse alliant des équipes académiques françaises (LRGP, Nancy ; LCPM, Nancy) et internationales (LGC, Liège, Belgique ; IBC, Moscou, Russie) ainsi que deux PMEs impliquées dans la conception de bioréacteurs (GPC, La-Rochelle ; Bio-Inox, Bergerac, France). Cette méthodologie conduira, dans un second temps, à la conception et à la construction d’un bioréacteur innovant d’une dizaine de litres, dédié spécifiquement à la culture de CSMh. Pour cela, le projet est décomposé en 4 tâches de travail.
L'objectif de la Tâche 1 (LGC, LRGP, GPC, Bio-Inox) est d'élaborer les outils de simulation numérique permettant une description Euler-Lagrange de l'écoulement solide-liquide. Les grandeurs Eulériennes de l'écoulement au sein de minibioréacteurs seront obtenues via des simulations CFD-RANS et validées expérimentalement (PIV, PLIF, mesure de P/V). Une description plus poussée de la turbulence sera menée par des simulations LES pour les conditions les plus prometteuses. La dynamique des particules sera étudiée numériquement (suivi lagrangien) et expérimentalement (trajectographie 3D), permettant d’établir, pour les microporteurs, leurs gradients de concentration, leurs probabilités de collision et leurs trajectoires afin d'accéder aux historiques de conditions hydrodynamiques particulaires. Un travail spécifique dédié à la conception et à la synthèse de microporteurs (Tâche 2.1, LCPM) et de microcapsules fonctionnalisées « à façon » (Tâche 2.2, IBC) sera mené pour répondre aux besoins physiologiques des CSMh, en mimant leurs niches organiques naturelles et pour espérer, à terme, une augmentation sensible des performances de production de cellules. Sur la base des premiers résultats obtenus, des configurations de mélange, d’aération et de matériaux utilisés pour l’adhérence cellulaire seront retenues. Pour celles-ci, des cultures de CSMh seront réalisées en minibioréacteurs agités les données recueilles seront analysées par les outils du génie biologique (vitesses de croissance, de consommation et de production) ou de biologie cellulaire (cytométrie en flux, RT-qPCR) (Tâche 3.1, LRGP, IBC, LCPM). L’ensemble des résultats obtenus seront mis en commun pour modéliser les couplages entre la réponse cellulaire (croissance, caractère souche) et le microenvironnement cellulaire (contraintes hydromécaniques) (Tâche 3.2, LRGP, LGC). Ce modèle hydro-biologique servira de base à la proposition de règles d’extrapolation et de conduite d’un procédé de culture à plus grande échelle (Tâche 4.1, LRGP, LGC, LCPM, GPC, Bio-Inox). Enfin, la conception du bioréacteur pilote devra répondre aux contraintes non seulement imposées par le modèle hydro-biologique, mais répondant également à un cahier des charges qui intégrera des critères règlementaires, de choix de matériau et de (éco)conception intégrée facilitant l’utilisation du bioréacteur, notamment en milieu hospitalier (Tâche 4.2, Bio-Inox, GPC). Ce système sera validé numériquement et expérimentalement par la mise en œuvre de culture de CSMh (Tâche 4.3, LRGP, GPC, Bio-Inox).