DS0303 - Produits (conception, procédés et matériaux)

Nouveaux analogues photoactivables de NADPH pour le suivi spatio-temporel de flavoenzymes – NOSTIME

Nouveaux analogues photoactivables de NADPH pour le suivi spatio-temporel de flavoenzymes

De nouveaux outils sont nécessaires pour étudier les mécanismes de protéines. Des nanoparticules et des quantum dots permettent de sonder des paramètres cellulaires spécifiques tels que le pH, l'état de redox sans perturber le système. De nouvelles approches pour isoler et déclencher un événement spécifique sont également nécessaires. Dans ce contexte, l' objectif de ce projet est de développer de nouveaux outils photoactivables qui peuvent déclencher une catalyse enzymatique spécifique.

Le projet développera de nouveaux outils pour les études résolues en temps de protéines qui surmontent la limitation de la lente (ms) diffusion de la sonde en se liant à la protéine.

L’objectif de ce projet est de développer de nouveaux outils photoactivables pour isoler et déclencher le processus catalytique spécifique sous impulsion laser. L’irradiation laser a lieu au temps zéro, permettant de contrôler à temps voulu l’initiation de l’événement catalytique. Actuellement, les molécules cagées ont été utilisées pour libérer les molécules actives, via la photodéprotection de la partie photolabile. Cependant, le temps de diffusion de la molécule active jusqu’à la protéine cible peut être trop long, donc inadéquate pour les étudies résolues dans le temps de protéines avec un rapide tourne-over. Notre projet représente une nouvelle approche pour synchroniser un ensemble de protéines en solution, en utilisant une sonde directement liée à la protéine, capable de déclencher la catalyse via l’injection ultrarapide des électrons à la protéine.

Ce projet est centré sur l’utilisation de nouveaux analogues photoactivables de NADPH, nommé nanotrigger (NT), ciblant le site de fixation de NADPH des oxyde nitrique synthases (NOS) et de cytochrome P450 réductase (POR) afin de stabiliser les enzymes sous forme fermée, facilitant ainsi la cristallisation. Dans ce projet, nous allons (1) déterminer la structure aux rayon X des complexes NT-protéines; (2) élucider la structure résolue dans les temps de la partie réductase et le mécanisme des premières étapes catalytiques par des études cinétiques en solution et la cristallographie au rayon X résolue en temps; (3) concevoir par simulation in silico et synthétiser de nouveaux activateurs spécifiques de l’eNOS; (4) suivre par excitation biphotonique le trafic d’eNOS dans la cellule grâce à des propriétés intrinsèques d’imagerie des NTs et leur spécificité.

Une nouvelle série de mimes de NADPH photoactivable contenant un ou deux O-carboxylmethyle sur la partie adénosine ont été synthétisée avec la chimie click. Ces molécules possèdent de bonnes propriétés d’asorption à un- ou deux-photons. Leur émission de fluorescence (longueur d’onde et rendement quantique, F) s’avère dependant de la polarité du solvant polarity, avec un shift vers le rouge dans un solvant plus polaire (?max,em = 460-467 nm, F>0.53 dans le DMSO, et ?max,em = 475-491 nm, F<0.17 dans le Tris). Ces composés possèdent de bonne affinité (de l’odre de dizaine de micromolaire) vis-à-vis de nNOS et eNOS, confirmant pour la première fois que le group carboxymethyle peut être utilisé comme substitut de phosphate. L’imagerie de fluorescence à deux-photon de ces molécules dans les celuules vivantes montre que la présence d’un group carboxymethyle en position 3’ du ribose favorise fortement l'adressage mimes de NADPH à l’eNOS dans le contexte cellulaire. Nous avons également montré que plusieurs composés sont capables d'induire le blebbing membranaire/ mort cellulaire par transfert d'électrons à NOS.
Pour améliorer la spécificité vis-à-vis de l'eNOS endothélial, nous avons conçu une nouvelle série de molécules ciblant les résidus spécifiques de l’eNOS pour la reconnaissance de NADPH, donnant les dérivés NT3a-c. Nous avons synthétisé 11 nouveaux nanotriggers. Ces composés présentent des propriétés photophysiques similaires à celles du NT2a-c, avec une stabilité améliorée, mais sans amélioration d’affinité vis-à-vis d'eNOS et de nNOS.

La modélisation moléculaire sera entreprise pour définir la structure précise de NT3,4 afin d'améliorer leur spécificité vis-à-vis d'eNOS en fonction des résultats obtenus. La synthèse de dérivés phosphates plus solubles est en cours, afin de réaliser la co-cristallisation avec les protéines. Avec les NT possédant des propriétés physicochimiques et photophysiques améliorées et de bonne affinité enzymatique, nous allons déterminer la structure cristalline des complexes NT-protéines (NOS et POR) et réaliser l'imagerie cellulaire de l'eNOS. Les études mécanistiques des intermédiaires catalytiques d’eNOS en solution ainsi que la détermination de la structure cristalline des complexes NT-protéines par cristallographie résolue dans le temps sera également réalisée.

1. Convergent synthesis and properties of novel photoactive NADPH mimics targeting nitric oxide synthases, N.-H. Nguyen, N. Bogliotti, R. Chennoufi, E. Henry, P. Tauc, E. Salas, L. J. Roman, A. Slama-Schwok, E. Deprez, J. Xie, Org. Biomol. Chem. 2016, 1

L’objectif de ce projet est de développer de nouveaux outils photoactivables pour isoler et déclencher un processus catalytique spécifique par impulsion laser. Cette impulsion laser fixe le temps zéro, et permet de synchroniser l’initiation de l’événement catalytique dans un ensemble de protéines natives en solution. Actuellement, des molécules cagées constituées d’une partie active (cofacteur, ligand) et d’un groupement photolabile sont utilisées pour contrôler le démarrage d’une réaction enzymatique, l’impulsion laser servant à la photo-déprotection de la partie active. Cependant, le temps de diffusion de la partie active jusqu’à la protéine cible peut être trop long, donc inadapté pour des études résolues dans le temps de protéines avec un cycle catalytique rapide. Notre projet représente une nouvelle approche pour synchroniser un ensemble de protéines en solution, en utilisant une molécule photoactivable directement liée à la protéine, capable de déclencher la catalyse par injection ultrarapide d’électrons à la protéine après impulsion laser.
Ce projet est centré sur l’utilisation de nouveaux analogues photoactivables de NADPH, nommés nanotrigger (NT), ciblant le site de fixation de NADPH des NO synthases (NOS) et de la cytochrome P450 réductase (POR) afin de stabiliser ces enzymes dans une conformation propice à la cristallisation. Ce projet permettra de (1) déterminer la structure aux rayons X des complexes NT-protéines; (2) élucider le mécanisme des premières étapes catalytiques des NOS et POR réductases à l’échelle moléculaire par des études cinétiques en solution; en parallèle, des études réalisées sur des cristaux de complexes NT-protéines permettront de « visualiser » à une résolution atomique, par cristallographie aux rayons X résolue dans le temps, les premières étapes catalytiques et les changements conformationnels leurs étant associés; (3) sur la base des structures des complexes, il sera possible de concevoir de nouveaux activateurs spécifiques de l’isoforme eNOS par modélisation moléculaire et de les synthétiser; (4) les propriétés intrinsèques d’imagerie de fluorescence des NTs et leur spécificité permettront, à l’échelle de cellules endothéliales vivantes, de suivre le trafic de l’enzyme eNOS par excitation biphotonique.
Le processus de photoactivation réalisé par NT s’inspire de la photosynthèse: il implique un changement du potentiel redox de la molécule active (NT lié à la NOS) par absorption d’un ou de deux photons, induisant un transfert d’électrons à la protéine. Ce concept ouvre des perspectives, notamment dans le domaine de la photosynthèse artificielle. De plus, la capacité de déclencher sélectivement l’activité d’enzymes telles que eNOS, impliquée dans la dysfonction endothéliale, ouvre aussi de nouvelles options thérapeutiques dans le traitement de maladies telles que l’hypertension, le diabète, et certains processus neurodégénératifs.
NOSTIME est un projet multidisciplinaire de recherche fondamentale, établissant de nouvelles collaborations internationales entre la France et les Etats Unis. Le partenariat français aux compétences multiples en synthèse organique (J. Xie), en modélisation moléculaire et en biophysique (A. Slama-Schwok), en fluorescence résolue dans le temps et en imagerie biphotonique (E. Deprez), est associé à un partenariat américain complémentaire expert en biochimie et en structure de NOS et P450 (L. Roman and J.J. Kim). Drs. Roman et Kim sont des collaboratrices de longue date dans les études de NOS. La synergie des partenaires en enzymologie des NOS, en cristallographie aux rayons X et la disponibilité d’instrumentation de pointe pour la cristallographie résolue dans le temps jointe au savoir-faire des équipes françaises en synthèse, modélisation et biophotonique rassemble en un seul consortium toutes les expertises nécessaires à la réalisation de ce projet, un atout majeur pour garantir le succès de ce projet.

Coordinateur du projet

Madame Joanne Xie (PPEM)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CNRS DR IDF SECTEUR SUD PPEM
PPSM Photophysique et Photochimie Supra- et Macromoléculaires
UMR8113 CNRS ENS Cachan Laboratoire de biologie et de pharmacologie appliquée
INRA, VIM Virologie et Immunologie Moléculaires
The University of Texas Health Science C Graduate School of Biomedical Sciences
Medical College of Wisconsin Department of BiochemistryH
CNRS CNRS PARIS VILLEJUIF

Aide de l'ANR 374 875 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2014 - 36 Mois

Liens utiles