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Structure et fonctions du cytosquelette bactérien lors du développement, en phase stationnaire, de la compétence et de la sporulation. – CytoStat

Structure et fonctions du cytosquelette bactérien lors du développement, en phase stationnaire, de la compétence et de la sporulation.

Dans ce projet de recherche, nous proposons de mener une approche <br />pluridisciplinaire (régulation transcriptionnelle, microscopie, biochimie) dans le but de caractériser l’organisation, l’éventuelle restructuration ainsi que les fonctions du cytosquelette d’actine (CA) en phase stationnaire.

OBJECTIFS, ORIGINALITE ET INNOVATION DU PROJET

Les objectifs de ce projet sont d'identifier et de caractériser l'organisation, l'éventuelle restructuration et les fonctions du CA, en phase stationnaire, lors du développement de la compétence et de la sporulation chez B. subtilis. <br />Le CA a été exclusivement étudié dans le contexte de la croissance bactérienne en phase exponentielle. La principale originalité de ce projet est donc d'examiner l'organisation et les fonctions du CA en phase stationnaire. <br />Une meilleure compréhension de la l'organisation et de la structure du CA chez le modèle procaryote devrait nous offrir, au final, de nouvelles perspectives quand à la compréhension des systèmes eucaryotes. Les résultats générés pendant cette étude pourrait offrir de nouvelles données à la recherche médicale. En effet, l'amélioration de notre compréhension des mécanismes régissant la synthèse et la remodelage de la paroi bactérienne pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles pour la création de nouveaux antibiotiques. De façon similaire, une meilleure compréhension des voies de régulation de la transformation génétique pourrait favoriser la maitrise de la plasticité génétique chez les bactéries et ultimement nous aider dans le combat mené contre le développement des souches multi-résistantes. Pour finir, la contamination de la chaine alimentaire par des spores de bactéries est un problème majeur de santé publique. La description des éventuels liens qui existeraient entre CA et sporulation pourrait générer de nouvelles cibles pour lutter contre la sporulation, en amont dans les chaines de fabrication, dans le but de garantir la qualité et la sécurité alimentaire.

Dans ce projet de recherche, nous proposons de mener une approche
pluridisciplinaire (régulation transcriptionnelle, microscopie, biochimie) dans le but de caractériser l’organisation, l’éventuelle restructuration ainsi que les fonctions du cytosquelette d’actine (CA) en phase stationnaire. Par exemple, le coordinateur pourra amener son expertise de l'utilisation de la luciférase de Photinus pyralys comme rapporteur transcriptionnel dans le but de décrire les profils d'expression des gènes du CA dans des milieux et des backgrounds génétiques différents. De plus, le laboratoire d'accueil, qui est l'un des leaders dans la description et la compréhension du CA chez les procaryotes, maîtrise parfaitement des techniques de microscopie avancées (TIRFM, microfluidic) permettant la visualisation optimale du CA. Finalement, plusieurs techniques permettant l'identification d'interactions protéine-protéine pourront être utilisées, in situ, dans le laboratoire ou le département d'accueil, dans le but d'établir des liens éventuels entre CA et compétence ou sporulation.

Nous avançons de front sur les 3 principales tâches définissant ce projet:
- nous avons construit les différentes fusions transcriptionnelles et somme en train de les analyser dans différents milieux et contextes génétiques. Déjà des résultats très intéressants apparaissent. Nous confirmons par exemple, l'induction de l'expression du gène mreB en compétence.
- nous avons également construit différentes fusions GFP-mreB sous le contrôle du promoteur natif (étape essentielle dans le cadre de notre projet). Nous commençons à regarder ces fusions sous le microscope et des localisations intrigantes commencent à apparaître. Par exemple, GFP-MreB est localisé sous forme de patch en phase exponentielle mais devient diffus en phase stationnaire en LB alors que GFP-Mbl reste sous forme de patchs tout au long de la croissance.
- finalement, nous avons commencé les pull-downs avec MreB et Mbl dans des conditions de compétence. De nombreux partenaires potentiels très intéressants ont été détectés. Ces partenaires sont par exemple impliqués dans la division cellulaire, la synthèse de la paroi et comme attendu dans la compétence.

Nous avons maintenant construit la quasi totalité des outils nécessaires dans le cadre de ce projet. D'autres pourrons être ajoutés à la liste en cours de route.
- dans le cadre des profils transcriptomiques nous devons continuer et tester différents milieux et l'effet de différentes délétions.
- pour la microscopie, nous devons caractériser en détails les localisations visualisées et se focaliser sur la compétence. Pour se faire, nous devrons co-localiser les membres du CA avec des protéines sur produites pendant la compétence.
- finalement, pour les pull-down, nous devons continuer notre liste de conditions et d'appâts. Nous devrons également réaliser un certain nombre de contrôles pour s'assurer que les candidats identifier sont bien spécifiques de la présence de nos appâts.

Pas encore.

Pendant des décennies, les scientifiques pensaient que la paroi rigide entourant les bactéries (prokaryotes) était le seul facteur déterminant la forme cellulaire. Chez les organismes supérieurs (eukaryotes), il est connu depuis longtemps que les cellules possèdent un réseau de protéines filamenteuses, particulièrement les filaments d’actine, qui contrôlent cette forme cellulaire. Ce réseau complexe est connu sous le nom de « cytosquelette ». Très récemment, il a été montré que les bactéries possèdent également un cytosquelette dynamique qui joue un rôle important dans l’organisation spatiale de processus essentiellement associés à la croissance cellulaire.
Dans ce projet de recherche fondamentale, nous proposons d’étudier le cytosquelette d’Actine (codé par les gènes mreB) lors du développement, en phase stationnaire, des deux principales adaptations environnementales que sont la compétence et la sporulation chez l’organisme modèle Bacillus subtilis. Le développement de ces deux processus, maintenant étudiés depuis plus de 80 ans, requiert un large remaniement de l’expression des gènes, de la localisation des protéines mais également de la forme de la cellule chez B. subtilis. Parce qu’elles sont très couteuses énergétiquement, ces adaptations physiologiques imposent un arrêt de croissance chez les cellules qui les ont initiées. Or il a été montré que l’expression des gènes mreB était induite lors du développement de la compétence et de la sporulation. Mais alors pourquoi induire l’expression du cytosquelette d’actine, l’un des déterminants majeurs de la croissance cellulaire par contrôle de la synthèse du peptidoglycane, alors que nous savons que les cellules arrêtent de se diviser en compétence et en sporulation ?
De nombreux résultats, publiés ou préliminaires, nous autorisent à spéculer quant à la signification de cette observation. Dans le cas de la compétence, de nombreux résultats préliminaires suggèrent que les protéines MreB et Mbl puissent jouer un rôle dans la réorganisation du peptidoglycane (paroi cellulaire), la localisation de certaines protéines de compétence ou dans l’acheminement de l’ADN transformant depuis son entrée dans le cytoplasme jusqu'au chromosome pour la recombinaison homologue. Dans le cas de la sporulation, la création d’une spore à l’intérieur de la cellule mère implique presque inévitablement une réorganisation massive du cytosquelette bactérien. Il a par exemple été montré chez Streptomyces coelicolor, qu’un mutant mreB génère des spores dont le volume a doublé et dont la paroi a perdu toute consistance. Ce travail suggère également que cette fonction de MreB associée à la sporulation puisse être conservée, au moins, chez les Streptomyces.
Dans ce projet de recherche, nous proposons de mener une approche pluridisciplinaire (régulation transcriptionnelle, microscopie, biochimie) dans le but de caractériser l’organisation, l’éventuelle restructuration ainsi que les fonctions du cytosquelette d’actine en phase stationnaire. Par exemple, le candidat pourra amener son expertise dans l’utilisation de la luciférase de Photinus pyralys comme rapporteur transcriptionnel et ainsi étudier les profils d’expression des gènes du cytosquelette dans différents milieux ou contextes génétiques chez B. subtilis. De même, le laboratoire d’accueil, leader dans la description et la compréhension des rôles du cytosquelette d’actine chez les procaryotes, pourra mettre à disposition plusieurs techniques de microscopie de pointe (TIRFM, microfluidique) permettant la visualisation optimale du cytosquelette bactérien. De la même façon, plusieurs techniques permettant l’identification d’interactions protéine-protéine seront disponibles, en local au sein du laboratoire ou de l’unité, pour établir d’éventuels liens entre cytosquelette et compétence ou sporulation.

Coordinateur du projet

Monsieur NICOLAS MIROUZE (Equipe Intégration Fonctionnelle des Processus Cellulaires, Groupe Cytosquelette et biogénèse de la paroi bactérienne (dirigé par Dr. Rut Carballido Lopez) UMR 1319 Micalis, INRA Jouy-en-Josas) – nicolas.mirouze@i2bc.paris-saclay.fr

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

UMR 1319 Micalis, INRA Jouy-en-Josas Equipe Intégration Fonctionnelle des Processus Cellulaires, Groupe Cytosquelette et biogénèse de la paroi bactérienne (dirigé par Dr. Rut Carballido Lopez) UMR 1319 Micalis, INRA Jouy-en-Josas

Aide de l'ANR 441 509 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2012 - 36 Mois

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