Importance des structures de type « R-loops » pour la condensation mitotique des chromosomes – TRACC

Nous avons cherché à développer des protocoles permettant une caractérisation poussée des structures de type R-Loops dans le génome de la levure S. pombe. Cela impliquait de pouvoir mesurer précisément la quantité de R-Loops se formant dans différents génotypes et de les cartographier de façon très précise, de façon à comprendre les facteurs favorisant leur formation. Pour les cartographier de façon précise, il était impératif de pouvoir identifier le brin d'ADN à l'origine de l'ARN hybridé. Pour cela, nous avons cherché à séquencer les molécules d'ARN hybridées pour nous donner non seulement une mesure au nucléotide près de la taille des R-Loops mais également pour nous permettre d'identifier le brin d'ADN à l'origine de l'ARN hybridé. Nous avons également cherché à faire varier la quantité de R-Loops dans le génome et à identifier les protéines capables de s'associer aux R-Loops. Nous avons tout particulièrement cherché à savoir si condensin pouvait d'associer aux R-Loops. Enfin, nous avons développé des protocoles pour visualiser à l'échelle de la molécule unique des R-Loops générées in vitro en utilisant la microscopie à force atomique (AFM).

Nos résultats confirment que la transcription est à l’origine de la structure chromatinienne qui attire condensin mais excluent que cette structure puisse être les R-Loops. Nos données indiquent plutôt que le stress topologique facilite l’association de condensin avec la chromatine. Nos études de la structure des R-Loops à l’échelle de la molécule unique nous permettent de proposer un modèle pour expliquer la toxicité des R-Loops et d’expliquer comment elles pourraient être à l’origine de nombreuses pathologies humaines. Nos travaux ont également considérablement amélioré les techniques d’études des R-Loops, leur quantification et leur localisation.

Nos travaux soulèvent de nombreuses questions qui feront l'objet de travaux futurs: 1. Nos travaux suggèrent que le stress topologique associé à la transcription facilite l'association de condensin avec la chromatine. Il est alors envisageable que la quantité de stress varie au cours du cycle cellulaire pour être maximale en début de mitose au moment où condensin se lie préférentiellement à la chromatine. 2. Si c'est le cas, comment la transcription produit-elle plus de stress en début de mitose? Quels sont les facteurs impliqués dans le contrôle du stress topologique au cours du cycle cellulaire? Peut-on suivre de façon dynamique la transcription des ARNs naissants au cours du cycle cellulaire? 3. Peut-on démontrer que ce stress est à l'origine de l'ADN simple brin qui est reconnu par condensin? En d'autres termes, est-ce qu'il y a co-localisation entre stress topologique, ADN simple brin et condensin en début de mitose? 4. Peut-on démontrer que la structure particulière des R-Loops que nous avons observées par microscopie AFM est responsable de leur toxicité?

Nos résultats ont déjà donné lieu à trois publications dans des journaux à comité de lecture. Deux manuscrits sont en préparation et seront soumis à l’automne 2016. Nous avons par ailleurs présenté nos travaux à l’oral au cours de huit conférences nationales et internationales.

Les anomalies chromosomiques sont des facteurs prédisposant à plusieurs maladies graves, tels certains troubles développementaux ou certains cancers. Comprendre les origines de ces altérations chromosomiques est un enjeu primordial de santé publique. Je m’intéresse aux mécanismes qui, en permettant l’assemblage et la transmission des chromosomes en mitose, empêchent les aberrations chromosomiques. Chez tous les eucaryotes, la chromatine se compacte en début de mitose et s’organise de façon à former des chromosomes parfaitement individualisés. Cette métamorphose, appelée « condensation mitotique », est réversible et essentielle à la transmission fidèle des chromosomes en anaphase et à la stabilité du génome nucléaire. Le caractère primordial de la condensation mitotique est également démontré par le fait que Rb, un gène suppresseur de tumeurs, régule la condensation des chromosomes et que cette fonction participe à son activité anti tumeur. La condensation des chromosomes en mitose a été observée pour la première fois à la fin du XIXème siècle. Malgré cela, les mécanismes moléculaires par lesquels la chromatine s’organise pour former un chromosome condensé restent méconnus.

De nombreuses données expérimentales suggèrent que la compaction de la chromatine est incompatible avec la transcription des gènes. L’interprétation qui prévaut généralement est que la compaction de la chromatine offre une barrière physique à la transcription, ce qui pourrait en partie expliquer la réduction de l’activité transcriptionnelle en mitose. Toutefois, des données publiées récemment suggèrent que la machinerie de transcription elle-même peut réguler directement le niveau de compaction de la chromatine, ce qui montre que les liens fonctionnels entre transcription et condensation sont plus complexes que ce qui est couramment envisagé. Mon hypothèse de travail, qui s’appuie sur des résultats préliminaires solides, postule que la réorganisation de la machinerie de transcription en début de mitose est un préalable nécessaire à la condensation des chromosomes. Mes données suggèrent que des changements de la composition de la machinerie de maturation des ARNs s’opérant en mitose contribuent à la condensation des chromosomes. Cette réorganisation est stimulée par un complexe protéique très conservé et aurait pour conséquence de générer transitoirement de l’ADN simple brin dans le génome. Cet ADN simple brin aiderait le recrutement sur la chromatine du complexe Condensin, qui représente l’activité principale de condensation de la chromatine en mitose. Ces données établissent un lien fonctionnel jusque-là insoupçonné entre une altération transitoire de l’activité transcriptionnelle des gènes, la production d’ADN simple brin et la compaction du génome. Le but de mon projet est de décortiquer ce nouveau mécanisme de régulation qui coordonne activité transcriptionnelle et condensation des chromosomes.

La recherche a tendance à se diviser en champs d’investigation indépendants qui communiquent assez peu entre eux. De façon à bâtir une vision holistique des phénomènes biologiques, il est essentiel d’établir des ponts entre disciplines. Le projet présenté ci-dessous participe de ce processus et contribuera à donner une vision globale des transitions qui s’opèrent sur les chromosomes au cours du cycle cellulaire.