Exploration fonctionnelle et structurale d'une nouvelle famille de protéines à activité RNase P – PRO-RNase P

Génétique, biologie moléculaire, biochimie, biologie structurale.

Résultats préliminaires
Partenaire 1
Développement d’outils (par virus induced gene silencing) pour l’analyse des protéines PRORP in vivo. Obtention d’une collection de mutants ponctuels ou de délétion des protéines PRORP. Obtention d’une collection de mutants ponctuels ou de délétion d’ARNt substrats de PRORP. Début de l’analyse croisée des différents mutants.
Partenaire 2 :
Mise en place de conditions d’expression et de purification des protéines PRORP à l’état soluble en grande quantité. Caractérisation des protéines PRORP par dichroïsme circulaire sous rayonnement synchrotron. Analyse des protéines PRORP par diffusion des rayons X aux petits angles. Détermination de conditions d’obtention de cristaux pour une protéine PRORP.

Fonction des protéines PRORP
- Identification des substrats de PRORP :
- Identification des partenaires protéiques des protéines PRORP :
- Éléments d'identité des substrats de PRORP :
- Éléments conservés des protéines PRORP :

Structure des protéines PRORP
- Recherche par criblage des conditions de cristallisation des protéines PRORP seules ou en complexe avec leurs substrats.
- L'analyse des cristaux sous rayonnement X synchrotron; détermination des structures 3D des objets cristallisés (protéines et ARN isolés ou en complexe).
- En parallèle à cette étude cristallographique, une étude structurale mettant à profit différentes méthodes biophysiques apportera des renseignements complémentaires telle que le comportement et la dynamique en solution, les paramètres thermodynamiques qui nous renseigneront sur le fonctionnement de ces systèmes.

Gutmann, B., Gobert, A. and Giegé, P. (2012) PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Dev. 26, 1022-1027.

La RNase P est essentielle pour obtenir des ARNt fonctionnels. L'enzyme clive la partie 5' leader des précurseurs d’ARNt. Jusque récemment toutes les RNases P caractérisées étaient typiquement des ribonucléoprotéines, comprenant une molécule d'ARN responsable de l'activité catalytique. Par conséquent, la RNase P était considérée comme l'un des très rares vestiges universellement conservés du « monde ARN » prébiotique. Cependant, ce dogme a été contredit quand les composants moléculaires de la RNase P ont été identifiés dans les mitochondries humaines et les organelles de plantes. Il s’agit d’un nouveau type de RNase P uniquement composé de protéines. Ces protéines que nous avons appelé PRORP pour «Proteinaceous RNase P» sont très répandues chez les eucaryotes. Elles contiennent deux à trois motifs pentatricopeptide repeat (PPR) et un domaine de type metallonucléase qu’on pense être impliqué dans l'activité catalytique proprement dite de la RNase P. Nos résultats montrent que PRORP seule effectue la maturation en 5’ des précurseurs d’ARNt qui caractérise l’activité RNase P.

La découverte et la caractérisation de ce nouveau type de RNase P protéique est très récente. Ainsi, la recherche proposée vise à étudier de manière beaucoup plus approfondie la fonction et le mode d'action des nouvelles RNase P protéiques. Cette recherche sera multidisciplinaire. Par des approches complémentaires, nous essayerons de comprendre comment les protéines PRORP fonctionnent. En particulier, nous identifierons tous les substrats des protéines PRORP in vivo et nous déterminerons la structure tridimensionnelle d'une protéine PRORP, seule et / ou en complexe avec son substrat précurseur d’ARNt. Cela permettra de comparer les enzymes PRORP avec les RNAses P ribonucleoprotéiques et montrera e.g. si PRORP a évolué pour mimer les RNAses P ribonucleoprotéiques bactériennes. Les résultats attendus permettront d'appréhender la diversité de fonction que les protéines PRORP peuvent avoir dans une cellule et comment ces fonctions sont intégrées dans les autres processus cellulaires. Elle indiquera comment les protéines PRORP fonctionnent, i.e. comment les séquences ou les structures influencent l'identification de substrats par PRORP et comment le clivage endonucléolytique proprement dit des ARN est catalysé par PRORP. Au delà de l'intérêt intrinsèque pour l’étude de processus biologiques fondamentaux, l'étude structure-fonction des protéines PRORP aidera à comprendre le mode d'action des protéines PPR en général. Cette étude aura donc un nombre très important d'applications possibles, par exemple d'intérêt agronomique et thérapeutique.