Microscopie en molecule unique des fourches de réplication inactivées – MicroRep

La technique de microscopie utilisée dans ce travail est particulièrement puissante et apporte des renseignements inédits. Elle permet d’observer des molécules uniques ou en très petit nombre fixées sur les chromosomes, de les compter, de mesurer leur temps de fixation. En faisant varier les conditions de croissance on peut identifier les facteurs qui contrôlent leur action.

Les premiers résultats montrent que des complexes multi-moléculaires de réplication considérés comme très stables se dissocient en leurs composants élémentaires lorsque la réplication est inactivée. Des protéines impliquées dans la stabilité du génome participent à cette dissociation, suggérant des pistes pour les liens entre défauts de réplication et instabilité des chromosomes. Ces résultats ont fait l’objet d’une publication dans Molecular Cell, un journal international de haut niveau, au début de l’année 2013.
Un deuxième thème de recherche a été abordé qui consiste à analyser la présence de protéines qui interagissent avec différents composants de la fourche de réplication, d’une part sur des fourches de réplication fonctionnelles et d’autre part sur des fourches inactivées. Plusieurs protéines, impliquées dans la recombinaison homologue (échanges entre séquences identiques) ou dans le redémarrage des fourches de réplication arrêtées, ont été marquées par des fluorophores. Ces protéines semblent toutes être systématiquement associées aux fourches de réplication en cours de progression dans des cellules sauvages.

La présence sur des fourches de réplication fonctionnelles de protéines qui ne seront nécessaires qu’en cas d’inactivation de la réplication montre l’importance de la bonne gestion des arrêts de la réplication (protection, redémarrage) pour la viabilité cellulaire.

Nous avons publié qu’après inactivation de la réplication la machinerie de réplication était partiellement démantelée, et que les enzymes de la recombinaison homologue jouent un rôle dans ce démantèlement dans le journal Molecular Cell.
Lia, G., Rigato, A., Long, E., Chagneau, C., LeMasson, M., Allemand, JF., Michel, B. (2013) RecA-promoted, RecFOR-independent progressive disassembly of replication forks stalled by helicase inactivation. Mol Cell, 49 1-11.

Les défauts de réplication sont une cause reconnue d’instabilité des génomes dans tous les organismes étudiés, car ils peuvent être à l’origine de remaniements de l’ADN. Cependant, les liens entre arrêt de réplication et instabilité génomique sont encore mal connus. Le but de ce projet est de comprendre les lois qui régissent les réactions se produisant aux fourches de réplication lorsque celles-ci sont inactivées accidentellement. Nous mettrons en œuvre une technique originale de microscopie permettant la détection d’une molécule fluorescente unique dans une bactérie en croissance, pourvus que cette molécule soit fixée à l’ADN, donc en action. Nous utiliserons la bactérie modèle Escherichia coli et la technique d’observation de molécules uniques par localisation du signal de fluorescence. Nous observerons en temps réel dans des bactéries en croissance dans un premier temps les protéines en action au cours de la synthèse des fragments d’Okazaki, et dans un deuxième temps les enzymes agissant sur des fourches de réplication inactivées.
Malgré l’existence d’un ensemble enzymatique dédié au redémarrage de la réplication chez E. coli, la plupart du temps les fourches de réplication inactivées ne redémarrent pas directement mais sont le siège de réactions variées, souvent catalysées par des enzymes de la recombinaison homologue. Les enzymes de la recombinaison agissent sur leurs substrats classiques, ADN simple-brin ou extrémités d’ADN double-brin, mais également directement sur les fourches de réplication pour y catalyser des réactions spécifiques. Nous proposons d’étudier les différentes étapes impliquées dans le redémarrage de la réplication à partir du blocage des fourches à l’échelle de la molécule unique in vivo en utilisant et en développant les méthodes les plus sensibles en microscopie optique. La méthode utilisée sera une méthode d’imagerie à l’échelle de la molécule unique, qui permet la détection de protéines fluorescentes individuelles à l’intérieur des cellules vivantes, et qui est connue sous le nom de détection par localisation du signal de fluorescence. Cette méthode est basée sur le principe qu’une seule molécule fluorescente peut être détectée en dépit du bruit de fond d’autofluorescence cellulaire, si elle est spatialement confinée pour un temps suffisamment long (quelques msec., plus long que le temps de diffusion typique dans la bactérie). Pour étudier les différentes étapes impliquées dans le redémarrage de la réplication, nous proposons d’utiliser un microscope équipé (i) d'un laser qui émet différentes longueur d’ondes, pour pouvoir exciter les différentes protéines fluorescentes utilisées, (ii) d’un système d'illumination stroboscopique, nécessaire pour augmenter le temps de vie des fluorophores utilisés, et (iii) d’un système de visualisation "dual view", pour suivre plusieurs protéines fluorescentes simultanément.
Grâce à la construction de protéines de réplication et de recombinaison portant une étiquette fluorescente, nous mesurerons la cinétique de désassemblage des complexes de réplication après inactivation, la cinétique d’action des enzymes de la recombinaison homologue et celle des enzymes du redémarrage de la réplication. Différents types d’arrêts de la réplication seront étudiés et comparés. Nous analyserons les réactions qui se produisent d’une part après inactivation d’une protéine essentielle du réplisome, et d’autre part après rencontre de la fourche de réplication avec un obstacle. Ce travail devrait nous permettre de comprendre comment et pourquoi différents arrêts de la réplication utilisent différentes voies pour le redémarrage des fourches de réplication, avec des conséquences variées sur la stabilité des génomes.