Neolectines: Lectines synthétiques à valence et spécificité contrôlées pour la biologie cellulaire et la biotechnologie – NeoLect

Les protéines ont été purifiées de sources naturelles ou produite de manière recombinantes dans E.coli. Les structures, spécificités et affinités des lectines ont été determinées par une combinaison de cristallographie, puce à sucre, résonance plasmonique de surface, thermal shift assay et microcalorimétrie de titration.

Les néolectines ont été conçues à partir d’une architecture en ?-propeller consistant en la répétition de 4 à 7 modules peptidiques. La modélisation moléculaire permet de déterminer les acides aminés impliqués dans la reconnaissance du ligand glucidique. Des mutations ponctuelles dans certains sites sont effectuées pour créer des lectines présentant des valences variées. La biologie moléculaire est utilisée pour créer de nouvelles protéines, les néolectines, avec six lames attachées par des peptides de liaison. Ces objets ont fait l’objet de mutagénèse dirigée.

Des lectines adoptant un fold b-propeller ont été identifiées dans des bactéries opportunistes et des champignons. Deux lectines ont été produites de facon recombinante et leur structure et leur spécificité ont été entièrement caractérisées. La lectine fongique recombinante se lie de manière spécifique à des N-glycannes tronqués présentant des GlcNAc terminaux et a donc la capacité de marquer les cellules tumorales.
Des modifications de la symétrie de l'architecture en b-propeller de la lectine de Ralstonia solanacearum (RSL) ont été effectuées pour produire une neoRSLs (nRSLs) de valence contrôlée. Plusieurs mutants ont été produits en invalidant les acides aminés les plus impliqués dans l’interaction avec le fucose. Sur les 9 mutants construits, seulement trois ont pu être obtenus sous forme soluble. La caractérisation de mutants a mis en évidence leur très grande stabilité. Des études ITC ont également été réalisées, elles ont mis en évidence que les mutations réduisent la stœchiométrie de six ligands à 3 ligands alors que l’affinité pour le méthyl-fucoside n'a pas été modifiée. En présence de vésicules géantes unilamellaires (GUVs) présentant du fucose, la lectines et les mutants se fixent sur les GUVs mais seule la lectine de valence six induit des invaginations de la membrane. En présence de cellules HeLa, les lectines mutées montrent une cinétique plus lente d'endocytose, ce qui démontre un effet important du degré de polyvalence sur la dynamique des membranes sur l’internalisation.
Les néolectines ont été conçues présentant 6 lames qui peuvent être modifiées indépendamment, et permettant donc la mise en place d’une bibliothèque de 13 protéines de valence controlée. De plus la position des sites peut être variée. Nous avons pu ainsi démontrer que l’avidité pour des surfaces glycosylées dépend du nombre de site mais est déjà très forte pour des néolectines à deux sites. Par contre la capacité à invaginer des membranes dépend de la distance entre les sites.

Nous avons atteint nos objectifs pour démontrer l’utilisation des lectines comme marqueurs de cellules cancéreuses et également pour développer l’ingéniérie de lectines de valence controlée. Les applications dans la compréhension de la dynamique des membranes ainsi que dans l’internalisation des bactéries pathogènes se sont révélées très intéressantes. Nous poursuivons nos travaux concernant le contrôle de la spécificité des lectines. Les techniques d’évolution dirigée par phage display se sont révélées plus complexes que prévus mais nous espérons obtenir des variants dans les prochains mois.

6 publications

1. Audfray, A.; ….. ; Le Pendu, J.; Römer, W.; Varrot, A.; Imberty, A. The fucose-binding lectin from opportunistic pathogen Burkholderia ambifaria binds to both plant and human oligosaccharidic epitopes. J. Biol. Chem. 2012, 287, 4335-4347.
2. Topin, J.; Arnaud, J.; Sarkar, A.; Audfray, A.; ….; Imberty, A.; Thomas, A. Deciphering the glycan preference of bacterial lectins by glycan array and molecular docking with validation by microcalorimetry and crystallography. PLoS ONE. 2013, 8, e71149
3. Audfray A., Varrot A. & Imberty A. Bacteria love our sugars: Interaction between soluble lectins and human fucosylated glycans, structures, thermodynamics and design of competing glycocompounds. C R Chimie 2013, 16, 482-490,
4. Arnaud J., Audfray A. & Imberty A. Binding sugars: from natural lectins to synthetic receptors and engineered neolectins. Chem. Soc. Rev. 2013, 42, 4798-4813,
5. Arnaud, J.; … Römer, W.; Imberty, A.; Audfray, A. Reduction of lectin valency drastically changes glycolipid dynamics in membranes, but not surface avidity. ACS Chem. Biol. 2013, 8, 1918-1924.
6. Arnaud, J.; Tröndle, K.; Claudinon, J.; Audfray, A.; Varrot, A.; Römer, W.; Imberty, A. Membrane deformation by neolectins with engineered glycolipid binding sites. Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 9267–9270.
7. Eierhoff, T.; Bastian, B.; Thuenauer, R.; Madl, J.; Audfray, A.; Aigal, S.; Juillot, S.; Rydell, G. E.; Müller, S.; de Bentzmann, S.; Imberty, A.; Fleck, C.; Römer, W. A lipid zipper triggers bacterial invasion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2014, 111, 12895-12900.
8. Audfray, A.; …Le Pendu , J.; Busser, B.; Imberty, A. A Recombinant Fungal Lectin for Labeling Truncated N-Glycans on Human Cancer Cells, PLOS One, (Accepted with minor modifications).

1 patent
Nouvelles lectines et applications pour la détection de marqueurs d’états pathologiques. A. Imberty, A. Audfray & J. Arnaud. Demande PCT en cours.

Les interactions entre protéines et glycanne sont impliquées dans de nombreuses fonctions biologiques telles que la signalisation, la migration cellulaire, la reconnaissance immunitaire et l’interaction hôte-pathogène. Cependant, en raison des difficultés d’analyse des glycannes, la Glycomique n’a pas encore atteint l’importance de la Génomique et de la Protéomique. Les lectines sont des protéines qui reconnaissent réversiblement et de manière spécifique les glucides présents sur les surfaces cellulaires. Elles sont couramment utilisées dans la caractérisation des glycannes et ont des applications biotechnologique en diagnostic car elles peuvent identifier de manière rapide les altérations de glycosylation corrélées à de nombreuses pathologies. Au cours des dernières années, des efforts importants ont été faits afin d’identifier de nouvelles lectines et de progresser dans la compréhension de leur fonction et des bases de leur interactions avec leur ligand glycannique. La production de lectines synthétiques présentant des propriétés nouvelles est un nouveau domaine de recherche qui stimule un fort intérêt.

Nous proposons de modéliser, concevoir et produire des néolectines modulables pour leur valence et leur spécificité et basées sur une architecture en beta-propeller. Ce repliement protéique consiste en la répétition de 4 à 7 modules, ou lames, d’environ 40 acides aminés. Parmi les quelques lectines en beta-propeller, la lectine à fucose de Ralstonia solanacearum (RSL) est produite sous forme recombinante et a une forte affinité pour des oligosaccharides fucosylés humains. Une autre lectine en beta-propeller d’origine fongique, (PVL from Psathyrella velutina), est également intéressante en raison de sa faible affinité les oligosaccharides sialylés.

Les néolectines à valence contrôlée seront conçues à partir du beta-propeller à 6 lames de RSL qui est formée par la trimérisation d’un peptide à 2 lames (6 sites fucose). La mutation des acides aminés du site de reconnaissance et la répétition de séquence seront utilisées pour créer des néolectines présentant des valences et des topologies variées. Ces néolectines seront des outils de choix pour étudier la dynamique de la membrane plasmique lors de l’interaction avec des toxines ou des virus. Le recrutement de glycosphingolipides et la formation d’invagination et de tubules seront analysés sur des cellules vivantes et sur des vésicules géantes unilamellaires. Le but sera de déterminer l’influence du nombre de sites de liaisons et de leur arrangement spatial dans la formation des tubules et le trafic intracellulaire des néolectines.

Des néolectines présentant une spécificité contrôlée seront conçues en utilisant une combinaison de modélisation moléculaire, mutagénèse dirigée et évolution dirigée, tout en gardant les avantages de l’architecture modulaire des beta-propellers. Les néoRSLs seront modifiées afin d’obtenir des spécificités pour différentes oligosaccharides fucosylés, en particurlier pour les épitopes Lewis X et Lewis Y qui sont surexprimés dans certains cancers. Les néoPVLs seront modifiées par ingénierie pour obtenir une haute affinité pour les oligosaccharides sialylés car les lectines à acide sialique ont des applications directes pour le diagnostic des carcinomes. L’ensemble de ces protéines seront testées sur des collections d’échantillons biologiques humains phénotypés tels que les salives et les puces de tissus. Enfin les néolectines présentant des spécificités pour les altérations de glycosylation observées dans certains carcinomes seront sélectionnées pour leur application possible en diagnostic.