Décryptage in vivo des interactions clefs initiales entre Bacillus anthracis et les systèmes lymphatiques, sanguins et les cellules immunes. – Deciphering In Vivo Host Anthrax Interac

Constructions des souches monofluorescente: Il s'agit de techniques de génétique bactérienne des bacilles Gram positifs (construction chez Escherichia coli et transfert par électroporation ou conjugaison hétérogramique).
Visualisation des infections ex vivo en microscopie biphotonique : Il s'agit de techniques de microscopie intravital adaptées à l'analyse d'organes en mouvement comme le poumon.

Constructions des souches monofluorescentes: Des difficultés ont été rencontrées. Des mutants avec intégration génomique sous contrôle du promoteur sspB ont été obtenus, mais ces constructions interféraient
négativement avec la sporulation. le promoteur scrA a été utilisé, car il est exprimé dans les spores et les bacilles et il est fonctionnel avec la GFP, la fluorescence étant faible dans les spores et intense dans les
bacilles. Ce promoteur a donc été cloné dans un vecteur approprié, et les gènes des protéines fluorescentes CFP, dnTomato, mCherry et Crimson ont été intégrées en aval.
Visualisation des infections ex vivo en microscopie biphotonique : L’analyse des infections pulmonaires ex vivo nécessitait de développer des techniques permettant un analyse de la dynamique des tissus après infection sous le microscope sur des durées de l’ordre de plusieurs heures afin de discriminer les répercutions physiologiques de l’infection sur les grandes fonctions cellulaires (viabilité, migration).Il a été développé ensuite des outils d’analyse des images par post-traitement sous un programme développé sur Matlab. Les mouvements parasites sont tous éliminés par recadrage des images par analyse de cross-corrélation sur le signal de génération de seconde harmonique (SHG) du collagène alvéolaire. Ce système de recadrage permet une analyse stable sur une longue durée.

Les résultats préliminaires permettent la mise en oeuvre de la phase effective du projet avec la mise en place de l'étude des modèles d'infection.

Publication:
D. Fiole, C. Touvrey, A. Quesnel-Hellmann, J. Douady, J.-N.
Tournier. Shape-based tracking allows functional discrimination of two immune cell subsets expressing the same fluorescent tag in mouse lung explant.
PLoS ONE, 2012;7(6):e39831. Epub 2012 Jun 22.

Communication orale:
D. Fiole, P. Deman, J. Mathieu, P.L. Goossens, J. Douady, J.-N. Tournier. Two-photon microscopy of inhalational anthrax infection reveals novel immunological synapses.
Bacillus ACT, Septembre 2013, Vancouver, Canada.

J.-N. Tournier. Two-photon imaging of pulmonary anthrax infection reveals novel immunological synapses.
ASM biodefense, Février 2013, Washington DC, Etats-Unis.

Ce projet s'inscrit dans la problématique de l'axe thématique 7 concernant l'analyse et l'évaluation du risque NRBC, et plus spécifiquement de la menace biologique provenant d'une contamination par Bacillus anthracis. Les retombées de la recherche proposée ont une dualité civile-militaire.
L’attaque bioterroriste aux spores du charbon en 2001 aux Etats-Unis a démontré les conséquences sévères sur la santé des personnels civils et militaires exposés aux spores de Bacillus anthracis, ainsi que la désorganisation majeure économique et sociale. Une meilleure compréhension de la maladie du charbon devrait permettre de diminuer les conséquences sur la santé d’une contamination, ainsi que de diminuer l’impact sur les coûts pour la société de tels actes bioterroristes. Les étapes initiales de la maladie du charbon sont très insuffisamment connues, en particulier les mécanismes précis utilisés par B. anthracis pour interagir, envahir et disséminer avec succès dans l’hôte infecté. De nombreuses données ont été obtenues dans des modèles in vitro, mais leur relevance physiologique est régulièrement questionnée. Le transfert à des modèles in vivo est sévèrement confronté au manque de méthodes appropriées.
Le projet de recherche proposé a pour but de visualiser in vivo et en temps réel les étapes initiales du charbon, tant cutané que inhalatoire, en combinant de puissantes approches méthodologiques complémentaires d’imagerie par fluorescence, microscopie biphotonique in vivo, et ex vivo reconstruction en 3D des tissus infectés par des souches de classe 3. Nous pourrons ainsi visualiser en temps réel l’entrée de B. anthracis, la dynamique locale de la différentiation bactérienne (germination et production des toxines et de la capsule) et définir de façon dynamique les effets subversifs exercés localement par les toxines sur les mécanismes de contrôle de l’hôte. Globalement, la combinaison des deux approches d’imagerie par fluorescence avec la cara trisation histologique des lésions et de la réponse immunitaire innée fournira une vision nouvelle de l’infection par B. anthracis.
Les retombées du projet seront en particulier : - une meilleure connaissance des étapes critiques initiales du charbon cutané et inhalatoire, - le développement de nouvelles approches moléculaires pour le traitement précoce de l’infection par B. anthracis, ainsi que dans les stratégies vaccinales, - le développement et l’utilisation des ces nouvelles technologies d’imagerie pour suivre en temps réel l’infection par d’autres agents pathogènes, en particulier d’intérêt de biosécurité - l’amélioration des contre-mesures à prendre en cas de menace bioterroriste