Expression d'un génome entier dans un système hétérologue acellulaire – ExEGeSyS

La Biologie de Synthèse est un domaine scientifique émergent combinant des connaissances avancées en biologie avec des concepts empruntés à la chimie, l’ingénierie et l’informatique. Son objectif global est de concevoir et de construire des systèmes synthétiques semblables au vivant ou vivants. L’une des stratégies pour atteindre ces objectifs est appelée « Bottom-Up » et propose une approche constructive dans laquelle des cellules seront reconstituées par assemblage de composants synthétiques.
D’importantes avancées conceptuelles ont déjà été franchies dans ces approches Bottom-Up, principalement par la co-encapsulation de plasmides et de systèmes d’expression acellulaires. Ces succès indiquent que la prochaine étape logique, l’encapsulation d’un génome complet, est désormais envisageable bien que complexe. De façon intéressante, introduire chromosome dans un compartiment hétérologue pour créer un organisme vivant a déjà été réalisé avec succès.
En effet, dans la transplantation de génome (Whole Genome Transplantation, WGT), un chromosome bactérien complet peut être transformé dans une cellule vivante compatible, et générer une population de cellules viables gouvernées exclusivement par le chromosome exogène.
Le succès de la WGT chez les mycoplasmes prouve que l’on peut :
i) Transférer un chromosome dans un compartiment contenant un système d’expression hétérologue ;
ii) Initier l’expression correcte du contenu chromosomique (« Boot-up ») ;
iii) Créer une cellule gouvernée par un génome exogène.
Étant donné les similitudes entre le Bottom-Up et la WGT, nous proposons d’utiliser la WGT comme modèle pour étudier les règles régissant les interactions entre un génome et un compartiment receveur dans un système acellulaire. En particulier, nous souhaitons explorer les déterminants de la compatibilité entre le génome Donneur et la machinerie du Receveur. Nous émettons l’hypothèse qu’un paramètre clé est la capacité de la machinerie du Receveur à « interpréter » (transcrire/traduire) les informations encodées sur le chromosome Donneur. Nous identifions en particulier comme étape critique du Boot-up la synthèse et l’assemblage correct de la machinerie d’expression du Donneur (ARN polymérase, facteurs de transcription, ribosomes), qui prendrait ensuite en charge l’expression du génome Donneur.
L’objectif du projet ExEGeSyS est ainsi d’utiliser la WGT pour étudier l’Expression d’un Génome Entier dans un Système hétérologue acellulaire. Pour atteindre cet objectif, nous proposons la méthodologie suivante :
Nous utiliserons les composants de la WGT pour établir un système expérimental in vitro appelé Whole Genome Expression Assay (WGEA). Dans le WGEA, un chromosome complet correspondant au génome utilisé comme Donneur dans la WGT sera incubé dans un extrait cellulaire préparé à partir des cellules utilisées comme Récepteur dans la WGT. L’expression génétique dans l’extrait sera analysée à la fois de manière ciblée, via RT-qPCR et Western-Blot, et de manière globale, via RNA-Seq et la caractérisation du protéome par spectrométrie de masse.
Nous réaliserons également des expériences de WGEA dans lesquelles des génomes Donneur et Receveurs seront ajoutés ensemble dans un extrait cellulaire. La comparaison des données d’expression obtenues lors de ces expériences « double génome » avec celles des expériences « Donneur seul » permettra de mieux comprendre le rôle du génome Receveur durant la WGT.
Nous testerons l’impact « d’enhancers » sur le Boot-Up. Ces molécules, ajoutées directement aux extraits cellulaires ou codées par le génome Donneur, devraient améliorer la reconnaissance de l’information génétique par la machinerie d’expression.
Enfin, nous travaillerons à la miniaturisation de nos expériences, en passant de réactions en lots (échelle microlitre) à des réactions compartimentées (échelle nanolitre), via l’encapsulation du génome Donneur dans des compartiments synthétiques de taille micrométrique.