Dynamique de la dégradation des inclusions lipidiques intrabactériennes chez les mycobactéries : Mise en évidence d'une plateforme lipolytique spécifique – DELIRIOUS

Les inclusions lipidiques intrabactériennes (ILI) revêtent une importance cruciale dans le cycle de vie des actinomycètes. Chez les mycobactéries pathogènes, telles que Mycobacterium abscessus, ces organites, gorgées de triglycérides, contribuent à la dissémination bactérienne et à la tolérance aux antibiotiques. Cependant, les mécanismes régulateurs et les principaux acteurs impliqués dans la synthèse et la dégradation des ILI demeurent insuffisamment compris. Grâce à la technologie APEX2 couplée à la spectrométrie de masse, que nous avons précédemment mis au point pour étudier la biogénèse des ILI, nous proposons d’implémenter ces techniques pour identifier et caractériser les principaux acteurs impliqués dans la dégradation des ILI chez M. abscessus, ainsi que d’évaluer leur importance dans la physiopathologie de cette bactérie à travers divers modèles in vitro, ex vivo et in vivo.
Les objectifs de DELIRIOUS sont multiples. Premièrement, nous étudierons la dynamique de dégradation des ILI chez M. abscessus en déterminant le proxysome des ILI. Nous validerons les données préliminaires obtenues pour examiner de manière exhaustive la cinétique de dégradation des ILI, y compris l’exploration du protéome de dégradation des ILI à différents temps, dans des conditions de culture favorisant leur consommation, ainsi que l’identification par spectrométrie de masse des protéines dont l’expression est induite lors de la dégradation des ILI. Deuxièmement, nous nous focaliserons sur la caractérisation d’un panel d'enzymes précédemment identifiées à différents temps d’hydrolyse pouvant constituer la base d’une « plateforme lipolytique » spécifiquement impliquée dans la dégradation des ILI. Nous sélectionnerons les candidats issus des proxysomes ayant un fort impact sur la dégradation des ILI, en utilisant un criblage combinant la technologie de CRISPRi et la quantification des triglycérides contenus dans les ILI. Les gènes correspondants à ces enzymes seront alors supprimés du génome de M. abscessus afin de générer des mutants stables, qui permettront de valider le rôle de ces enzymes cibles dans le métabolisme des ILI in vitro, ainsi que leur éventuelle implication biosynthétique avec les lipides complexes de la paroi mycobactérienne. Enfin, les protéines cibles identifiées ayant les effets les plus marquants sur la dégradation des ILI seront caractérisées biochimiquement (mesure de l’activité enzymatique, spécificité des substrats et tests d’inhibition).
Dans un troisième volet, nous examinerons l'influence de cette plateforme lipolytique sur la physiologie, la virulence et la pathogénèse de M. abscessus, grâce à des expériences d’infection menées soit dans le modèle ex vivo des macrophages spumeux, soit chez l'embryon de poisson zèbre. Ces deux modèles complémentaires, précédemment validés pour l’étude des ILI chez les mycobactéries, permettront de déterminer l’importance des enzymes dégradant les ILI dans le processus d’infection par M. abscessus, en quantifiant la charge bactérienne, la survie des bacilles dans les macrophages spumeux et la mortalité des embryons infectés.
L'approche innovante de DELIRIOUS réside dans un large éventail de techniques combinant la biologie cellulaire, la microbiologie, la biochimie et la protéomique, toutes parfaitement maitrisées par les deux équipes partenaires. Ce projet apportera de nouvelles informations sur le métabolisme des ILI chez M. abscessus en particulier, ainsi que chez les actinomycètes en général. A terme, DELIRIOUS devrait également permettre l'identification de nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique pour lutter contre les infections à M. abscessus, qui demeurent extrêmement difficiles à éradiquer.