Facteurs d’assemblage des machines moléculaires de polymérisation d’actine branchée – MachActAssembly

Les machines moléculaires doivent être construites par des facteurs d'assemblage pour remplir leur fonction. Les intermédiaires sont dégradés par des mécanismes de contrôle qualité lorsqu'ils ne peuvent atteindre l'assemblage complet en raison de l'absence d'une sous-unité ou d'un facteur d'assemblage. Nous proposons ici d’identifier systématiquement les facteurs d’assemblage de trois machines moléculaires qui polymérisent l'actine branchée : les complexes WAVE, WASH et Arp2/3 qui contrôlent conjointement la persistance de la migration cellulaire.
À cette fin, nous utiliserons tout d'abord des cribles d'interactomique à grande échelle, non biaisés, avec les sous-unités de ces complexes en utilisant des cribles double-hybride (Y2H) chez la levure et de la protéomique après purification par affinité en tandem (TAP) des sous-unités. Pour identifier les partenaires directs parmi les candidats, nous automatiserons une procédure de prédictions structurales à partir d’AlphaFold2 en délimitant les domaines conservés au cours de l'évolution afin d'augmenter la vitesse et la précision des prédictions. Les modèles structuraux fournis par AlphaFold2 seront validés expérimentalement dans le Y2H en mutant les résidus de l'appât prédits comme étant critiques pour l'interaction et en sélectionnant des mutations compensatoires en utilisant un crible Y2H après mutagenèse aléatoire des proies.
Les facteurs d'assemblage candidats seront ensuite identifiés par génomique fonctionnelle à l’aide d’une lignée de cellules rapporteuses qui expriment une sous-unité de chacun de ces trois complexes étiquetée avec une protéine fluorescente différente. Les siRNAs qui déstabilisent un complexe, mais pas les trois, sont susceptibles de correspondre à un facteur d'assemblage spécifique. La propriété attendue d'un facteur d'assemblage est de produire des défauts de migration cellulaire (WAVE, Arp2/3) et de trafic intracellulaire (WASH, Arp2/3) après knock-down et knock-out, selon la fonction de la machine moléculaire dont il favorise l'assemblage.
Dans une dernière partie, les données d’interaction et fonctionnelles seront intégrées dans un scénario structural. Les complexes intermédiaires dans la voie d'assemblage seront caractérisés avec plusieurs expériences de pulse-chase. Dans la cellule, les phénotypes de knock-out devraient être sauvés par le facteur d'assemblage de type sauvage, mais pas par les versions mutées. En utilisant cette combinaison d'approches globales et non biaisées, nous espérons disséquer les voies d'assemblage de ces trois machines moléculaires qui contrôlent la polymérisation de l'actine branchée. Ces connaissances fondamentales pourront probablement être exploitées comme de nouvelles manières de contrôler ces machines moléculaires critiques impliquées dans plusieurs pathologies humaines.