Exploration des paysages transcriptionnels des bactéries cultivables et non cultivables de l’intestin humain à l'aide d'émulateurs in vitro de la transcription. – RNADarkMatter

Le projet développe une approche méthodologique combinant l'apprentissage actif (Active Learning) et l'automatisation à haut débit pour explorer un espace combinatoire de l'ordre du million de compositions de systèmes acellulaires (cell-free systems). Cette exploaration vise à maximiser la production d'ARNm pour étudier l'expression de génomes entiers. En combinant des expériences successives avec une méthode d’optimisation bayésienne, cette approche permet d’identifier efficacement les formulations de tampons les plus adaptées tout en améliorant la fiabilité des modèles prédictifs.

L’expression du génome est réalisée dans des systèmes acellulaires optimisés, puis étudiée en analysant les ARN produits, notamment grâce au séquençage direct d’ARN avec la technologie Oxford Nanopore (MinION).

Cette approche, qui combine l’optimisation des conditions expérimentales, le séquençage en temps réel et l’analyse des données avec DESeq2, un outil bio-informatique permettant de comparer les niveaux d’expression des gènes entre différentes conditions, permet de caractériser précisément les variations de l’expression des gènes et la maturation des ARN.

Cette méthode évite certaines des complexités liées à l’étude des cellules vivantes, où de nombreuses régulations interagissent entre elles. Elle permet ainsi d’étudier plus directement les processus de l’expression des gènes.

Le projet ANR RNADARKMATTER a franchi plusieurs étapes majeures, avec des avancées importantes à la fois sur le plan technologique et scientifique.

Grâce à l’intelligence artificielle et à une méthode d’apprentissage permettant d’optimiser progressivement les conditions expérimentales, l'équipe a multiplié par 20 la production d’ARN messager dans des systèmes acellulaires. Cette avancée a permis, pour la première fois, d’obtenir une vision complète des ARN produits par un virus grâce au séquençage direct sur nanopores.

Ces résultats ont donné lieu à une publication dans la revue internationale Nature Communications (doi.org/10.1038/s41467-026-74559-y). Les codes et les données produits dans le cadre du projet ont également été rendus accessibles à la communauté scientifique via Zenodo et le NCBI, dans une démarche de science ouverte.

Les chercheurs ont également réussi à intégrer une machinerie bactérienne fonctionnelle dans ces systèmes, ouvrant la voie à leur utilisation pour étudier des organismes plus complexes.

Les travaux ont par ailleurs bénéficié d’une forte visibilité internationale, avec une présentation à la conférence SEED 2025 en biologie synthétique et une invitation à l’Université d’Oxford pour la conférence Biological Control Systems 2026.

Avec mon étudiant en thèse Gabin Derache, nous avons développé un lysat d’E. coli contenant une ARN polymérase bactérienne hétérologue. Cette avancée ouvre la voie à l’utilisation de ces systèmes acellulaires pour produire et étudier des ARN de manière contrôlée, sans avoir recours à des cellules vivantes. Nos prochaines étapes viseront à optimiser cette nouvelle machinerie par apprentissage par transfert (transfer learning). En utilisant les données acquises lors de nos travaux précédents sur la polymérase T7, nous pourrons accélérer l’optimisation de la production d’ARNm et adapter plus rapidement les conditions expérimentales à cette nouvelle polymérase.

À terme, nous chercherons à utiliser cette machinerie pour exprimer un génome bactérien complet. Cette étape permettra de tester notre approche sur un système biologique environ cent fois plus grand que le phage T7 et soumis à des mécanismes de régulation beaucoup plus complexes. Elle ouvrira ainsi de nouvelles possibilités pour étudier, dans un environnement contrôlé, comment un génome bactérien est exprimé et régulé, mais aussi pour développer des systèmes acellulaires capables de produire des ARN et des protéines à partir de génomes de plus en plus complexes.

Mon projet vise à développer une plateforme in vitro permettant d'exprimer et d'étudier l'expression génétique chez des bactéries modèles et des bactéries non-modèles, cultivables ou non-cultivables du microbiome intestinal humain.
Les organismes non-cultivables représentent la grande majorité des bactéries intestinales mais sont mal connus. La diversité de leurs conditions de croissance, de leurs comportements et de leurs compositions rend les protocoles standard d'expression génétique et de production de protéines inefficaces limitant la compréhension de ces organismes.
Je propose d'utiliser des systèmes « cell-free » et de construire une collection de plasmides conçus pour émuler les machines de transcription d’organismes du microbiote intestinal humain. Les systèmes « cell-free » sont constitués d'un mélange contenant un extrait cellulaire complété par un tampon énergétique et des acides aminés. Comme les processus de transcription et de traduction restent actifs, des protéines peuvent être produites directement en ajoutant de l'ADN. Le protocole nécessite de grands volumes de culture qui ne peuvent être obtenus avec des organismes non-cultivables en laboratoire. Cependant, le système « cell-free » peut produire des machineries de transcription d'organismes non-modèles.
L'objectif de cette plateforme est d'exprimer des génomes complets ou partiels (naturels, amplifiés par PCR ou synthétisés) d'une manière systématique et contrôlée. Je mesurerai les transcriptomes exprimés dans une large gamme de conditions (différents facteurs sigma, régulation de la transcription ). Ce projet jettera les bases de la génomique fonctionnelle pour des organismes dont seule la séquence génétique est connue.