Analyse de l'expansion du peptidoglycane chez les bactéries à Gram positif par combinaison de la spectrométrie de masse et de la microscopie à haute résolution – MAPEX

Le projet MAPEX vise à mieux comprendre les mécanismes moléculaires d’assemblage du peptidoglycane et de sa cinétique d’expansion au cours du cycle cellulaire. Le peptidoglycane (PG) est une molécule géante à structure réticulée composée de chaînes glycanes pontées par des tiges peptidiques. Malgré des décennies de recherche, reste encore la question du fonctionnement du PG en expansion, caractérisé par une chorégraphie intriquant enzymes de polymérisation des chaînes glycanes et enzymes lytiques ménageant dans le PG l’espace requis pour l’insertion des chaînes glycanes.
Le projet MAPEX se fonde sur les synergies attendues de l’expertise des trois partenaires : (1) biochimie du PG (marquages isotopiques couplés à la chromatographie liquide-spectrométrie de masse, LC-MS), (2) microscopie de localisation de molécule unique (direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy, dSTORM) et (3) chimie de synthèse.
Le marquage total du PG avec les isotopes 13C et 15N et l’analyse par LC-MS des fragments obtenus révèleront, au niveau sub-moléculaire, le mode d’insertion des chaînes glycanes dans le PG en expansion. L’imagerie par dSTORM résolue en temps de bactéries dont le PG aura été marqué par chimie click avec un fluorophore révèlera les sites d’expansion du PG et sa cinétique au cours du cycle cellulaire. La structure de nanodomaines de PG sera déterminée par une méthode de type LC-MS protéomique “middle-down”: le PG de bactéries marquées avec les isotopes stables et avec un dérivé chimie click de biotine subira une digestion ménagée et les nanodomaines obtenus seront purifiés par chromatographie d’affinité à la streptavidine pour une caractérisation par LC-MS.
Par la mise en œuvre des méthodes ci-dessus sur des bactéries à Gram positif de morphologies, de modes d'expansion du PG et de mécanismes de résistance aux antibiotiques variés, le projet MAPEX dévoilera des processus moléculaires cruciaux pour comprendre et combattre la prolifération bactérienne.