Mélanisation intense des endophytes fongiques septés foncés : un trait avantageux pour la colonisation des plantes et la tolérance au stress – DARKandSTRONG

Les différentes voies de synthèse de la mélanine ont été étudiées dans un panel d'Ascomycètes via des approches d'exploration génomique et d’études phylogénétiques. Afin d'identifier de nouveaux inhibiteurs ou inducteurs de la mélanisation, un criblage de composés chimiques a été réalisé. Pour obtenir des mutants génétiquement modifiés produisant une faible ou une forte quantité de mélanine au niveau de leurs hyphes, deux approches génétiques ont été entreprises. La première approche a consisté à obtenir des mutants KO après transformation avec Agrobacterium tumefaciens. L'ADN génomique des mutants a alors été extrait et séquencé afin de localiser le site d'insertion de l'ADN-T. La deuxième approche a consisté à développer la stratégie CRISPR/Cas9. La modification de l'intensité de la mélanisation a également été testée à l'aide de tests d'acclimatation. Les différents mutants ont été testés pour leur capacité à tolérer différents stress abiotiques (métaux, chaleur, sel) et biotiques (amibe). Notamment, divers agents chimiques ont été utilisés pour tester l'intégrité de la paroi cellulaire et les propriétés hydrophobes de la surface. Le stress oxydatif a également été analysé en étudiant la sensibilité aux ROS de mutants déficients en mélanine. En ce qui concerne les interactions biotiques, un test de viabilité à haut débit a été adapté pour suivre la survie des champignons en co-culture avec l'amibe fongivore Protostelium aurantium. De plus, les interactions champignon-amide ont été analysées au microscope photonique. Enfin, une première étude d’'interaction plante-champignons (mélanisés ou non) a également été réalisée dans deux sols contaminés ou non par des métaux. Les paramètres morphométriques des plantes ont été mesurés.

Chez les champignons ascomycètes, les trois voies de synthèse de la mélanine sont présentes. En effet, les gènes impliqués dans les différentes étapes de la synthèse de la mélanine ont pu être identifiées à partir des données génomiques des espèces fongiques que nous avons sélectionnées. Cependant, la voie DHN-mélanine semble être la plus prédominante. En effet, lors de l'utilisation d'un inhibiteur spécifique de cette voie, la mélanisation était presque supprimée. Seuls des composés intermédiaires ont été accumulés dans les colonies. A l’inverse, les inhibiteurs spécifiques des autres voies ont très peu réduit le niveau de mélanisation des hyphes. L'approche par agrotransformation a permis d'obtenir plusieurs centaines de mutants et cinq mutants faiblement mélanisés ont été identifiés. Un mutant hyper-pigmenté a également été sélectionné à partir de cette approche. Le nombre d'insertions de T-DNA variait d’un à trois dans les mutants que nous avons analysés. Les insertions n'étaient pas présentes dans les gènes impliqués dans la synthèse de la mélanine, mais dans d'autres gènes dont la fonction n'est pas encore connue, ce qui suggère un impact indirect de ces mutations sur le processus de mélanisation. L'approche complémentaire CRISPR/Cas9 a été initiée en développant des vecteurs spécifiques pour la transformation de nos espèces fongiques modèles. L'approche d'acclimatation a été couronnée de succès, car certains stress abiotiques ont eu un impact positif sur le niveau de mélanisation des colonies. Le criblage des composés chimiques a également été couronné de succès, car il a permis de découvrir de nouvelles molécules inhibitrices de la mélanisation. Dans certains cas rares, des inducteurs de mélanisation ont également pu être trouvés. En ce qui concerne les tests phénotypiques visant à étudier le niveau de tolérance du champignon en réponse aux stress abiotiques, les premiers résultats montrent que la mélanine joue un rôle clé dans l'intégrité structurelle de la surface, car les mutants déficients en mélanine étaient plus sensibles aux perturbations de la paroi cellulaire. Dans les tests d'interaction biotique, Protostelium aurantium a considérablement réduit la viabilité et la croissance radiale du champignon, confirmant le rôle de la mélanine et de la surface cellulaire dans la résilience du champignon au stress et son importance dans les interactions écologiques. Enfin, le DSE Rhexocercosporidium a amélioré la tolérance de sa plante hôte lorsqu'elle était soumise à un stress métallique. La croissance et le fitness des plantes inoculées n'ont pas été affectées, alors que de nombreux symptômes ont été observés chez les plantes non inoculées.

Dans la prochaine phase du projet, l’objectif sera de poursuivre nos recherches sur d'autres mutants albinos et d'autres facteurs de stress. L'impact de certains composés chimiques sur la production de mélanine sera étudié plus finement à l'aide de cinétiques temporelles et d’établissement de courbes dose-réponse. Les différents mutants seront exposés à divers facteurs de stress et des études omiques seront menées afin de mettre en évidence la régulation fine des voies de synthèse de la mélanine, ainsi que l'effet indirect qu'une variation de la mélanisation pourrait avoir sur la physiologie du champignon. Les recherches sur l'interaction entre taux de mélanine et stress environnementaux seront approfondies en incluant des facteurs de stress supplémentaires et en combinant l'analyse de la croissance radiale avec des évaluations de viabilité. Des études d'interaction de surface seront réalisées à l'aide d'un microscope à force atomique. Différentes espèces végétales seront inoculées par des mutants contrastés pour leur niveau de mélanisation et le devenir de l’interaction plante-champignon sera évalué, notamment au niveau du taux de colonisation des racines par les différentes souches plus ou moins mélanisées. L’ensemble de ces recherches permettront d'améliorer notre compréhension des mécanismes de défense dépendants de la mélanine et de proposer le développement de souches fongiques résistantes au stress. À terme, cela contribuera à l'application des endophytes septés sombres dans les domaines de l’agriculture durable et de la biofertilisation, conformément aux objectifs à long terme du projet.

Les endophytes septés foncés (dark septate endophytes - DSE) sont un assemblage polyphylétique d'ascomycètes qui colonisent les racines des plantes et sont caractérisés par une accumulation prononcée de mélanine au niveau de leurs hyphes. De nombreux auteurs ont émis l’hypothèse que ce trait pourrait être avantageux pour les deux partenaires des associations plante-DSE en réponse à divers stress biotiques et abiotiques. Cependant, la démonstration expérimentale de la contribution d’une forte mélanisation des DSE à l'atténuation du stress fait encore défaut. Par analogie aux pathogènes fongiques pour lesquels la mélanisation est requise pour leur virulence et l’infection de tissus animaux et végétaux, nous émettons l’hypothèse que la mélanine pourrait également jouer un rôle dans la pénétration des racines par les hyphes des DSE et la colonisation qui s'ensuit. Dans ce projet collaboratif franco-allemand, nous visons à mieux comprendre le processus de mélanisation chez une espèce DSE modèle (Leptodontidium sp.), en réalisant un focus sur les mécanismes modulant le niveau de mélanisation. Des approches génétiques, pharmacologiques, physico-chimiques, physiologiques et omiques complémentaires seront également utilisées pour décrypter le rôle que la mélanine pourrait jouer dans la compétitivité de Leptodontidium sp. pour la colonisation des plantes et dans la tolérance élevée de Leptodontidium sp. à une gamme de stress abiotiques et biotiques.
Le consortium est composé de chercheurs de quatre laboratoires ayant une expertise complémentaire en microbiologie, dans l’étude des interactions plantes-microorganismes sous conditions de stress, en écologie fongique, en analyses multi-omiques et en bio-informatique. Les techniques et les savoir-faire particuliers sont la transformation génétique des DSE et la microscopie à force atomique (Université de Lorraine - P1), les analyses de microRNA et le stress métallique (Université de Bourgogne Franche-Comté - P2), l'épigénétique et le séquençage RNAseq (Université Friedrich Schiller de Jéna - P3), et les interactions entre les champignons et les mycoparasites (Université des Sciences Appliquées de Wismar - P4). Ainsi, les réponses aux questions posées concernant le rôle de la mélanine au niveau des DSE et des interactions DSE-plantes ne pourront être apportées que par les activités conjointes du consortium franco-allemand.
La compréhension des mécanismes qui atténuent le stress environnemental au niveau des DSE et des plantes qu’ils colonisent pourrait contribuer à l'exploitation de cette ressource fongique pertinente pour la production durable et économiquement significative de cultures végétales qui font face à des contraintes croissantes, dont la présence d'organismes mycophages et phytopathogènes dans la rhizosphère, l'exposition aux contaminants, et les impacts du changement climatique tels que la sécheresse et les fortes chaleurs. Par conséquent, nous viserons également à assurer une large diffusion des résultats du projet à la fois auprès de la communauté scientifique, de la société et des professionnels des domaines de l'agriculture, de l'horticulture et de la sylviculture.