Conceptions d'inhibiteurs de phosphopantetheinyl transferases de bactéries pathogènes – DIPTOP

De nombreuses mycobactéries sont des pathogènes pour l’homme : Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agent étiologique de la tuberculose, a causé près de 1,6 millions de décès en 2021, et Mycobacterium abscessus (Mab) induit des infections pulmonaires chez les patients atteints de mucoviscidose ou aux défenses affaiblies. Des traitements existent mais ils sont longs et présentent de nombreux effets secondaires. De plus, dans le cas Mab, les traitements sont rendus inefficaces par sa résistance intrinsèque et acquise.
Ces bactéries expriment chacune 2 phosphopantetheinyl transférases (PPTase), essentielles à leur survie, qui transfèrent le bras phosphopantetheinyl (P-pant) du coenzyme A (CoA) au domaine transporteurs d’acyl (ACP) des polykétides synthases (PKS), des synthétases d’acides gras et de peptides non ribosomiques (NRPS). PptT, chez Mtb, et PptAb chez Mab, partagent 69 % d’identité de séquences et activent l’ensemble des PKS et NRPS de ces bactéries.
Un criblage cristallographique de 943 fragments (poids moléculaire d’environ 200 Da) sur l’enzyme PptAb a permis d’identifier près de 50 composés se fixant proche du CoA. Le projet DIPTOP vise à optimiser les ligands les plus prometteurs pour obtenir des candidats médicaments inhibiteurs de PptAb et de son orthologue PptT chez Mtb, in vitro et in vivo.
Ces structures mettent en évidence 3 sites clés pour l’interaction avec l’enzyme : une région polaire conduisant à un tunnel hydrophobe dans lequel vient se loger le bras P-pant du CoA à pH acide, une région lipophile à proximité de l’adénine du CoA, et une interaction polaire avec le glutamate 153. Cinq composés présentant ces interactions sont sélectionnés pour être optimisés et leur conférer des propriétés d’inhibition de PptT et/ou de PptAb et une activité antimicrobienne sur Mtb et/ou Mab. Ils ont été choisis sur la base de leur diversité moléculaire et de leur accessibilité en synthèse. Leur optimisation sera guidée par des données structurales (cristallographie aux rayons X), biophysiques (nanoDSF, TRIC, spectral shift, calorimétrie par titration isotherme), enzymatiques (inhibition du transfert) et fonctionnelles (inhibition de la croissance des bactéries).
La production de PptT et PptAb recombinantes en grande quantité et avec un excellent degré de pureté est parfaitement maitrisée, préalable indispensable aux caractérisation biophysiques et structurales nécessaires au projet. Des nouvelles techniques biophysiques sont actuellement déployées à l’IPBS (nanoDSF, spectral shift et TRIC) qui sont particulièrement adaptées à la mise en évidence d’interaction protéine-ligand et à la détermination des constantes de dissociation des complexes, même avec une affinité faible. La détermination de la structure de ces protéines, que ce soit sous forme isolée ou de complexe est également maitrisée.
Un test enzymatique est disponible au laboratoire, qui permet de visualiser la réaction de transfert du bras P-pant vers un domaine ACP par électrophorèse. En cas de nécessité, un test plus sensible, basé sur la polarisation de fluorescence, décrit dans la littérature, sera mis en place.
La détermination d’une activité antimicrobienne sur des bactéries pathogènes à croissance lente comme Mtb et Mab pour de nombreux composés peut se révéler problématique. Un test de compétition de croissance a donc été développé, utilisant M. smegmatis (Msm), une mycobactérie non pathogène à croissance rapide, avec une paroi semblable à celle de Mab ou de Mtb. Msm, transformée pour exprimer soit PptT soit PptAb, en fusion avec la GFP, est mis en coculture avec Msm exprimant Sfp, la PPTase de Bacillus subtilis, en fusion avec la mCherry. Ces 3 PPTases complémentent PptMs la PPTase de Msm, délétée chez ces souches modifiées. Après incubation avec les composés à évaluer, la nature de la fluorescence observée (aucune, GFP, mCherry ou GFP et mCherry) permet de déterminer si le composé cible effectivement PptT ou PptAb.