Analyse en molécule unique de la réplication du génome humain – SMAHGR

La réplication de l'ADN est le processus biologique le plus vital. La duplication fidèle du génome est critique pour la préservation de l'identité cellulaire, de l'intégrité génomique et du cycle cellulaire. Des défauts de réplication sont associés à des maladies du développement, au vieillissement et au cancer. Notre but est de profiler la réplication du génome humain entier à l'échelle de la molécule unique (MU). Nous utiliserons des techniques de séquençage nanopore, d'intelligence artificielle (IA) et de modélisation cinétique développées et validées par notre consortium pour quantifier précisément l'initiation, la progression et la terminaison de la réplication le long du génome de plusieurs lignées cellulaires et pour déchiffrer les déterminants (épi)génétiques de ces processus. Les origines de réplication sont marquées en phase G1 du cycle cellulaire par le chargement de l'hélicase réplicative MCM sous forme inactive sur l'ADN double brin. Elles sont activées à différents moments de la phase S par des facteurs qui activent l'hélicase et recrutent les ADN polymérases et facteurs accessoires nécessaires à la synthèse processive de l'ADN. Seule une fraction des MCM est activée, le reste est inactivé par la progression des fourches de réplication depuis les origines actives. Le moment d'activation des origines et la progression variable des fourches résulte en un programme spatiotemporel de réplication du génome, régulé au cours du développement, corrélé à l'activité transcriptionnelle, la structure chromatinienne et l'évolution du génome et parfois altéré dans des pathologies. Des analyses de populations cellulaires humaines ont auparavant identifié des milliers de zones d'initiation et de terminaison (ZI et ZT), mais elles ne révèlent que des tendances moyennes qui masquent l'hétérogénéité cellulaire sous-jacente. A l'inverse, les techniques MU peuvent révéler aussi bien les évènements rares que fréquents et mesurer la progression de fourches individuelles. Nous avons récemment développé une technique MU basée sur le séquençage nanopore (FORK-seq) qui nous a permis de déterminer à haute résolution la position et l'orientation de centaines de milliers de fourches chez la levure S. cerevisiae, redécouvrir les origines et termini connus, révéler des évènements dispersifs non capturés par les techniques populationnelles, et établir la première carte pangénomique de vitesse de progression des fourches individuelles. Nous postulons que la réplication du génome humain démarre aux ZI prédominantes détectées en analyse populationnelle puis se propage par initiation dispersive détectable uniquement en MU. Nous utiliserons FORK-seq pour tester ce scénario et explorer la variabilité intercellulaire et spatiale dans l'initiation, la progression et la terminaison de la réplication dans les cellules humaines. Par modélisation cinétique et IA, nous avons pu extraire de profils populationnels un paysage d'initiation probabiliste (PIP) qui, inséré dans nos simulations, prédit ces profils avec exactitude et contient donc toute l'information qui détermine le programme de réplication à haute résolution. Nous affinerons encore ce PIP avec les données FORK-seq et par IA prédirons ce PIP seulement à partir de la séquence de l'ADN et de profils épigénomiques. Les techniques d'explicabilité de l'IA permettront d'estimer pour chaque locus la contribution activatrice ou répressive de signaux (épi)génétiques proches ou distants et élucideront ainsi comment de multiples signaux se combinent pour déterminer le PIP. Des outils semblables permettront d'élucider les déterminants du paysage de progression des fourches. La modification du génome par CRISPR-Cas 9 genome confirmera le rôle des déterminants ainsi identifiés. Ce projet apportera une contribution majeure à la compréhension scientifique d'un processus biologique fondamental qui a résisté à des décennies d'investigation et a de nombreuses implications médicales, technologiques et sociétales.