Répertoire des ARNm à coiffe hypermodifiée et étude de leur mécanisme de traduction – ReCAPtrans

Les modifications épigénétiques d’ARN sont un moyen de réguler l'expression des gènes. La traduction canonique coiffe-dépendante repose sur la reconnaissance d'une coiffe 7-méthylguanosine (m7G) en 5' des ARNm par le facteur d'initiation eIF4E. La stricte dépendance à l'interaction eIF4E/m7G a été remise en question par de multiples analyses transcriptomiques. Nous avons identifié le premier exemple de modification épigénétique de la coiffe chez les mammifères et montré que les ARNm de sélénoprotéines liés au stress ont une coiffe hypermodifiée TMG. Ces ARNm ne sont pas reconnus par eIF4E, mais néanmoins traduits par un mécanisme qui reste à élucider. L’existence d’autres ARNm à coiffe TMG a été suggérée. Nous avons identifié l'ensemble du répertoire des ARNm à coiffe TMG au niveau transcriptomique par immunoprécipitation de la coiffe et RNA-seq (TMG RIP-seq). Ces ARNm à coiffe TMG sont principalement impliqués dans la traduction, la réponse au stress, la protection antioxydante et la prévention des cancers.

Notre hypothèse est que la coiffe TMG permettrait aux ARNm d’être dirigés vers des voies de traduction spécialisées. L'objectif du projet ReCAPtrans est de déterminer le rôle de la coiffe TMG dans la traduction et la localisation des ARNm, d'identifier les facteurs de traduction associés et de caractériser le répertoire des ARNm à coiffe TMG dans des conditions de stress pour comprendre le rôle de cette modification dans la régulation de la traduction.

Le rôle de la coiffe TMG dans la traduction d’ARNm endogènes sera étudié par analyse de polysomes et IP TMG en conditions normales ou d'inhibition de la traduction canonique par la torin-1. Des ARNm modèles transcrits in vitro à coiffe TMG ou m7G permettront de décrypter leurs mécanismes de traduction dans des extraits acellulaires ou in vivo. La coiffe TMG est impliquée dans la localisation fonctionnelle d’ARN non codants. Son impact sur la localisation cellulaire des ARNm sera analysé par fractionnement subcellulaire et immunolocalisation. Le rôle potentiel de protéines de liaison à la coiffe TMG, connues pour leur implication dans le trafic nucléocytoplasmique sera analysé.

Pour capturer les facteurs d'initiation natifs impliqués dans la traduction des ARNm à coiffe TMG, nous utiliserons une méthode de purification des particules de ribosome/ARNm dédiée à l'analyse protéomique. Ceci permettra de déterminer la composition des complexes d'initiation utilisés par ces différents types d'ARNm, les facteurs de liaison à la coiffe et les facteurs auxiliaires. Leur validation sera effectuée par des tests classiques d'interaction ARNm-protéine ou protéine-protéine. Leur impact sur la traduction des ARNm TMG endogènes sera testé par siRNA. Une attention particulière sera accordée aux protéines impliquées dans des voies de traduction alternatives telles que les facteurs d'initiation eIF4G2, eIF3 et de liaison à la coiffe.

Le répertoire d’ARNm endogènes à coiffe TMG sera déterminé par TMG RIP-seq dans différents types cellulaires (HEK293FT, HeLa ou HEPG2) ou diverses conditions de stress (stress oxydant, conditions hypoxiques, privation d'acides aminés). Ceci déterminera si la traduction des ARNm à coiffe TMG est régulée.

Des modèles des voies de traduction spécifiques des ARNm à coiffe TMG seront proposés. Les modifications épigénétiques de la coiffe de l'ARNm n'ont jamais été étudiées. ReCAPtrans devrait élucider un nouveau mécanisme de régulation de la traduction chez les eucaryotes. Comprendre le rôle du stress cellulaire dans la régulation traductionnelle est particulièrement pertinent dans le cas de pathologies telles que le cancer.