La double vie des domaines KKE/D désordonnés de l'ARN polymérase I et des snoRNPs : de la modification de l'ARNr à la compaction nucléolaire – DUKKED

Les étapes précoces de la synthèse des ribosomes nécessitent le recrutement de nombreux facteurs d'assemblage et de maturation (AMF), qui interagissent avec les transcrits naissants de l'ARN polymérase I (ARN PI). Parmi eux, des petites particules ribonucléoprotéiques nucléolaires (snoRNP) sont recrutées pour synthétiser des modifications chimiques de nucléotides (méthylations et pseudouridylations), qui sont importantes pour le repliement des ARN ribosomiques (ARNr) et la fonction du ribosome. Comment les cellules eucaryotes organisent spatialement et temporellement les étapes précoces de l'assemblage des ribosomes reste mal compris. De nombreuses protéines nucléolaires contiennent des régions intrinsèquement désordonnées (IDR), dont les fonctions dans l'activité des protéines et l'organisation nucléolaire restent débattues. Notre projet se concentre sur une IDR abondante appelée domaine KKE/D, présente exclusivement dans l’ARN PI, dans les snoRNP et des ARN hélicases impliquées dans la dynamique des snoRNP. Nos données préliminaires montrent que les domaines KKE/D ont une double fonction dans la modification des ARNr et la (ré)organisation nucléolaire en fonction de l'activité de l’ARN PI. En effet, des mutants dépourvus des domaines KKE/D des snoRNP présentent des défauts de modification des ARNr et d’organisation nucléolaire en croissance exponentielle et post-diauxique. Ce dernier défaut est associé à un retard de reprise de croissance lors du transfert en milieu frais.

Le but du projet DUKKED est d'explorer le double rôle des domaines KKE/D dans la modification des ARNr et l'organisation nucléolaire. Nous décrypterons chez la levure les mécanismes de recrutement des snoRNP sur le pré-ARNr lors de la transcription par l’ARN PI. Nous évaluerons l'importance des domaines KKE/D pour l'organisation nucléolaire, la transcription par l’ARN PI, la maturation du pré-ARNr, la traduction et la croissance, dans les cellules en croissance exponentielle et lors de l’adaptation à des stress d’inhibition de la synthèse de l'ARNr. La fonction des domaines KKE/D sera également étudiée dans les cellules humaines afin de révéler la conservation évolutive de ces mécanismes.

Nous répondrons spécifiquement à trois questions :

Quel est le rôle des domaines KKE/D dans la chronologie de synthèse des modifications de l'ARNr? En utilisant les technologies de RiboMethSeq, HydraPsiSeq et CRAC, nous démontrerons que les domaines KKE/D favorisent la synthèse précoce des modifications et nous explorerons leur chronologie de synthèse dans les précurseurs précoces de l'ARNr et les transcrits naissants (WP 1).

Comment les domaines KKE/D maintiennent-ils la compartimentalisation du nucléole? Grâce à des expériences de Co-IP, Turbo-ID et de microscopie de pointe, nous caractériserons l'interactome des domaines KKE/D et leur importance pour l'organisation nucléolaire en croissance exponentielle. De plus, nous décrypterons les mécanismes permettant aux domaines KKE/D de promouvoir la compaction nucléolaire lors de l'inhibition de la transcription par l’ARN PI. En utilisant des approches de microscopie quantitative, nous caractériserons les propriétés physiques des condensats de domaines KKE/D formés in vivo et in vitro (WP 2).

Quelle est la fonction des domaines KKE/D dans la physiologie cellulaire et l'adaptation au stress? Nous étudierons l'importance des domaines KKE/D pour tous les mécanismes physiologiques liés à la biogenèse des ribosomes et la traduction : la transcription par l’ARN PI, la maturation des pré-ARNr et la traduction. Par des cinétiques de transfert en milieu frais de cellules post-diauxiques sauvages ou dépourvues des domaines KKE/D, nous identifierons les fonctions des domaines KKE/D qui sont nécessaires à l'adaptation au stress (WP 3).

Notre étude permettra d'élucider la fonction cruciale des domaines KKE/D dans l'adaptation dynamique de la disponibilité des snoRNP et de l'organisation nucléolaire à l’activité de l’ARN PI.